恥垢分枝桿菌MSMEG-6402基因的克隆、表達(dá)及功能鑒定.pdf

1、結(jié)核病(Tuberculosis，TB)主要是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的，多種耐藥性結(jié)核菌株的出現(xiàn)以及臨床抗結(jié)核藥物的缺乏，致使結(jié)核病發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，尋找新的藥物靶點(diǎn)、開(kāi)發(fā)能有效治療多重耐藥結(jié)核的抗結(jié)核藥物亟待解決。
　　 細(xì)胞壁是分枝桿菌賴(lài)以生存的重要屏障，而聚阿拉伯糖是細(xì)胞壁的核心組分。聚阿拉伯糖基的活性供體被證實(shí)是聚十異戊二烯磷酸阿拉伯糖（Decapreny

2、l-phospho-arabinose，DPA）。近幾年，隨著磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Rv3806c)和差向異構(gòu)酶（Rv3790/Rv3791）功能的揭示，DPA特異的合成途徑逐漸被闡明，是由三個(gè)連續(xù)反應(yīng)組成:(1)Rv3806c催化5-磷酸核糖焦磷酸（PRPP）轉(zhuǎn)移到聚十異戊二烯磷酸(DP)分子上形成5-磷酸核糖聚十異戊二烯磷酸(5-P-DPR);(2)磷酸酶催化5-P-DPR分子上的5-磷酸基團(tuán)水解形成聚十異戊二烯磷酸核糖(DPR);(3)

3、Rv3790/Rv3791催化DPR生成DPA。在此途徑中，催化5-P-DPR脫磷酸的磷酸酶尚未被鑒定。而與Rv3806c處于同一啟動(dòng)子的Rv3807c通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)具有磷酸酶功能結(jié)構(gòu)域，該蛋白被推測(cè)催化5-P-DPR生成了DPR。非致病菌恥垢分枝桿菌的MSMEG-6402基因是Rv3807c基因的同源基因，本論文通過(guò)在大腸桿菌BL21(DE3)中將MSMEG-6402基因克隆、可溶性表達(dá)并純化，建立MSMEG-6402蛋白的體外酶

4、活測(cè)定方法，對(duì)MSMEG_6402的功能進(jìn)行闡明，這將有助于完善對(duì)于DPA合成代謝途徑的認(rèn)識(shí)以及尋找新型抗結(jié)核藥物靶點(diǎn)。
　　 本研究的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括:1）構(gòu)建pET16b-MSMEG-6402表達(dá)質(zhì)粒，在BL21(DE3)中進(jìn)行可溶性表達(dá)，并用鎳-組氨酸親和層析法對(duì)帶有N-末端組氨酸標(biāo)簽的MSMEG-6402蛋白進(jìn)行純化，通過(guò)SDS-PAGE和Western-blotting對(duì)表達(dá)蛋白和純化蛋白進(jìn)行檢測(cè)鑒定;2）由于5-P-DP

5、R反應(yīng)直接底物的缺乏，需要偶聯(lián)Rv3806c參與的酶促反應(yīng)來(lái)完成酶活檢測(cè)，因此我們采用與MSMEG-6402相同的表達(dá)載體和菌株對(duì)Rv3806c蛋白進(jìn)行可溶性表達(dá)并純化，通過(guò)SDS-PAGE和Western-blotting進(jìn)行檢測(cè)鑒定;3）根據(jù)底物DP/PRPP和產(chǎn)物DPPR/DPR的性質(zhì)及其消耗產(chǎn)出量的變化，分別采用孔雀石綠-鉬酸銨測(cè)磷法、薄板層析法(TLC)以及質(zhì)譜法(MS)對(duì)MSMEG-6402純化蛋白的功能活性進(jìn)行檢測(cè)。

6、>　　 研究結(jié)果如下:
　　 1)成功對(duì)MSMEG-6402基因和Rv3806c基因在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行可溶性表達(dá)，通過(guò)Ni-NTA純化獲得目的蛋白，分子量分別為20kDa和33kDa;
　　 2)建立MSMEG-6402蛋白功能活性的測(cè)定方法，對(duì)其磷酸酶活性進(jìn)行鑒定:孔雀石綠-鉬酸銨測(cè)磷法對(duì)反應(yīng)生成的游離單磷酸進(jìn)行檢測(cè)，觀察到MSMEG-6402蛋白參與的反應(yīng)組明顯的顏色和OD630值變化，陰性對(duì)照組與

7、空白對(duì)照組結(jié)果相近;TLC法對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物DPPR和DPR進(jìn)行檢測(cè)，由于二者均為糖脂化合物，同時(shí)采用糖顯色和脂顯色，以DP和PRPP為底物對(duì)照，樣品組有DPPR和DPR的生成，而陰性對(duì)照組只有DPPR的生成;MS法對(duì)底物DP/PRPP的消耗量和產(chǎn)物DPPR/DPR的生成量進(jìn)行直接檢測(cè)，結(jié)果顯示DP/PRPP有一定量的消耗，同時(shí)DPPR/DPR有相應(yīng)的峰出現(xiàn)。
　　 綜上所述，本研究利用不同的方法對(duì)MSMEG-6402蛋白的功能進(jìn)行了