分枝桿菌蚯蚓血紅樣蛋白MSMEG-6212的功能分析.pdf

1、結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）感染引起的傳染性疾病，它是全球范圍內(nèi)死亡率最高的傳染性疾病之一?？股貞?yīng)用于結(jié)核病的治療后，這種疾病的死亡率呈現(xiàn)出了明顯的大幅度下降。但是近些年，由于多耐藥結(jié)核(Multiple drug-resistance TB，MDR TB)和廣泛耐藥結(jié)核(Extensively drug-resistance TB，XDR

2、TB)的出現(xiàn)，這種古老的疾病又重新呈現(xiàn)出蔓延的趨勢(shì)，給全球的衛(wèi)生與健康帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制的深入研究將為防癆工作提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)。蚯蚓血紅蛋白是一種含鐵的攜氧非血紅素蛋白質(zhì)，從原核生物到真核生物中都普遍存在。這種蛋白結(jié)合鐵中心部位處存在一些保守的氨基酸殘基，能夠形成一個(gè)保守的H-HxxxE-HxxxH-HxxxxD框，簡(jiǎn)稱為HHE結(jié)構(gòu)域。通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析，在M.tb的模式菌株—恥垢分枝桿菌（Mycobacteri

3、um smegmatis）中存在三個(gè)蚯蚓血紅樣蛋白:MSMEG_2415、MSMEG_3312和MSMEG_6212。我們實(shí)驗(yàn)室前期的研究工作顯示，蚯蚓血紅樣蛋白(Hemerythrin-like protein)參與分枝桿菌的耐藥調(diào)節(jié)和氧化還原調(diào)控，其中MSMEG_2415與細(xì)菌應(yīng)對(duì)H2O2脅迫相關(guān)，MSMEG_3312與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐受相關(guān)。
　　本研究系統(tǒng)的分析了蚯蚓血紅樣蛋白MSMEG_6212在恥垢分枝桿菌的生物學(xué)功

4、能。首先，我們通過噬菌體同源重組特異轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法成功構(gòu)建了msmeg_6212敲除菌株Δ6212。實(shí)驗(yàn)證明，與野生型標(biāo)準(zhǔn)株mc2155相比敲除菌株Δ6212表現(xiàn)出了對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥，這一表型與先前已鑒定的另一個(gè)基因msmeg_3312的敲除菌Δ3312相似。同時(shí)，過表達(dá)msmeg_6212可以增加細(xì)菌對(duì)紅霉素的敏感性。但是MSMEG_6212并不像MSMEG_3312一樣表現(xiàn)出氧脅迫相關(guān)性。為進(jìn)一步探究MSMEG_6212和MSME

5、G_3312的在調(diào)節(jié)紅霉素耐藥的關(guān)系，我們構(gòu)建了msmeg_3312和msmeg_6212雙基因敲除菌株Δ3312-6212。藥物抑制實(shí)驗(yàn)和藥物致死實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示雙敲除細(xì)菌并沒有呈現(xiàn)耐大環(huán)內(nèi)酯類藥物效應(yīng)的放大，其抗性與單基因敲除菌株的表型相當(dāng)。另外，msmeg_3312的敲除降低了msmeg_6212的轉(zhuǎn)錄;當(dāng)msmeg_6212敲除并不能影響msmeg_3312的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)MSMEG6212和MSMEG_3312