結(jié)核分枝桿菌Cas蛋白表達(dá)純化與功能研究.pdf

1、近來在大多數(shù)的細(xì)菌(40％)和幾乎所有的古細(xì)菌(90%)的基因組中,人們發(fā)現(xiàn)一類成簇的、有規(guī)律間隔的短回文重復(fù)結(jié)構(gòu)家族(clusteredregularlyinterspaced short palindromic repeats,CRISPR)。CRISPR主要用于細(xì)菌防御外來噬菌體、病毒的侵襲,從而使細(xì)菌能夠在殘酷的自然環(huán)境中生存下來,是一種適應(yīng)性的免疫機(jī)制。CRISPR系統(tǒng)的作用是提供對噬菌體特異性免疫,在生物醫(yī)學(xué),生物工業(yè)上都有

2、廣闊的前景。
　　 結(jié)核病是目前單一致病菌中致死率最高的傳染病之一,我國是全球結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一,結(jié)核病患者人數(shù)位居世界第二。結(jié)核病的病原體是結(jié)核分枝桿菌,結(jié)核分枝桿菌易發(fā)生耐藥性,近年來世界各地結(jié)核分枝桿菌的多耐藥菌株和泛耐藥菌株逐漸增多,甚至引起暴發(fā)流行,使得目前的藥物已不足以抑制。因此,對于結(jié)核病的致病菌——結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)制和免疫機(jī)制的深入研究顯得極為重要。CRISPR系統(tǒng)是結(jié)核分枝桿菌重要的免疫機(jī)制之一,本研究著

3、重于對結(jié)核分枝桿菌的CRISPR系統(tǒng)中的Cas蛋白進(jìn)行初步探索。
　　 根據(jù)目前在一些細(xì)菌中的研究成果,預(yù)測結(jié)核分枝桿菌也存在CRISPR系統(tǒng)。CRISPR系統(tǒng)包括一系列Cas蛋白,這些蛋白協(xié)助CRISPR系統(tǒng)發(fā)揮免疫作用。CRISPR系統(tǒng)發(fā)揮免疫作用分為兩個步驟。首先,噬菌體入侵細(xì)菌,Cas蛋白將其識別,并整合到宿主的基因組上。然后,噬菌體第二次入侵,CRISPR系統(tǒng)能夠識別外源噬菌體,用具有特異性核糖核酸內(nèi)切酶功能的Cas蛋

4、白將其切割,外源噬菌體失去毒力,免疫過程結(jié)束。在這個過程中,Casl和Cas2蛋白參與獲取外源噬菌體基因的過程,Cas6蛋白是核糖核酸內(nèi)切酶,能夠切割CRISPR repeat RNA,在宿主細(xì)菌防御外源噬菌體的過程中扮演了重要的角色。
　　 本研究首先成功構(gòu)建了3個重組表達(dá)質(zhì)粒MBP-Rv2816、MBP-Rv2817以及MBP-Rv2824,并在原核中得到高效表達(dá)。目的基因Rv2816、Rv2817以及Rv2824對應(yīng)的目的

5、蛋白分別是Casl-mbp、Cas2-mbp以及Cas6-mbp。我們選擇的表達(dá)質(zhì)粒是PDB-His-MBP載體,MBP標(biāo)簽大小為45KDa。載體上的標(biāo)簽MBP可增加在細(xì)菌中過量表達(dá)的融合蛋白的溶解性,尤其是真核蛋白。純化蛋白使用的是鎳離子親和層析的方法。帶有His標(biāo)簽的融合蛋白特異性結(jié)合在鎳離子親和層析膠體(即柱材料)上。結(jié)合在柱材料上的融合蛋白可用400mM高濃度咪唑的生理緩沖液進(jìn)行洗脫。
　　 就三個目的蛋白的表達(dá)情況來看

6、,16℃誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白Casl-mbp和Cas6-mbp有較好的溶解性,Cas2-mbp在純化得到之后,降解程度嚴(yán)重。將融合蛋白Cas6-mbp用于后續(xù)功能的研究,在體外構(gòu)建了Cas6-mbp蛋白切割CRISPR-repeat RNA和切割CRISPR-spacer RNA的體系。實(shí)驗(yàn)樣品分為兩組,反應(yīng)底物分別是CRISPR-repeat RNA和CRISPR-spacer RNA.在RNA的量不變的條件下,Cas6-mbp蛋白的量

7、沿梯度濃度增高。實(shí)驗(yàn)另外設(shè)置有RNA陰性對照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cas6蛋白能夠切割CRISPR-repeat RNA,但不能夠切割CRISPR-spacer RNlA。
　　 本研究初步闡釋了結(jié)核分枝桿菌中存在CRISPR系統(tǒng),驗(yàn)證了在結(jié)核分枝桿菌基因組中確實(shí)存在Casl、Cas2、Cas6蛋白基因,并且能夠進(jìn)行表達(dá)純化,其中Cas6蛋白具有核糖核酸內(nèi)切酶的功能。這一研究結(jié)果可能有助于對結(jié)核分枝桿菌免疫機(jī)制的深入了解,對以后的生物醫(yī)