結核分枝桿菌九種蛋白抗原克隆表達純化及多重感染研究.pdf

1、結核病(Tuberculosis，TB)仍然是僅次于艾滋病(acquired immune deficiencysyndrome，AIDS)，在全球范圍內(nèi)由單一傳染病病原體引起的危害人類健康的最大殺手。我國是22個結核病高負擔國家之一，僅次于印度。同時，我國耐多藥結核(MDR-TB)日益增多，且結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtuberculosis）與人類免疫缺陷病毒(Human immunode

2、ficiency virus，HIV)共同感染的人數(shù)持續(xù)增加，加重了結核病危害和防治工作的難度。目前，尚無有效、快速地診斷結核病的方法，同時，已經(jīng)有研究證實BCG的保護效果不理想，尚無有效的預防結核病的疫苗。結核分枝桿菌蛋白抗原的研究在開發(fā)新型結核病診斷方法和研究新型結核病疫苗中都存在著重要的作用。
　　傳統(tǒng)的觀點是，結核病是由單一的結核分枝桿菌感染引起的，且這種感染對外源性的再感染具有免疫保護作用。近年來，隨著對結核病分子流行病

3、學研究技術的發(fā)展、結核病感染傳播機制研究的深入，人們對結核分枝桿菌的多重感染有了更深刻的認識。結核分枝桿菌的多重感染是指在結核病人體內(nèi)先后或者同時感染2種或2種以上的不同基因型的結核分枝桿菌。
　　首先，通過文獻查閱、免疫表位數(shù)據(jù)庫(Immune epitopedatabase and analysis resource，IEDB)查詢等方法，篩選出九種結核分枝桿菌蛋白抗原，分另為MPT64、TB10.4、HSP70、HSP65、

4、PPE68、CFP10、EspJ、EspK和Mas，進行了克隆表達和純化。同時，本研究隨機選取37株結核分枝桿菌臨床分離株，5μm孔徑濾膜過濾法制備單個細菌菌懸液，改良羅氏培養(yǎng)基（L(o)wenstein-Jensen slants,L-J培養(yǎng)基）接種37℃培養(yǎng)，選取生長良好的單個菌落進行培養(yǎng)增菌，提取基因組DNA。采用Spoligotyping(Spacer oligonucleotidetyping)和15位點的MIRU-VNTR(

5、Mycobacterial interspersed repetitiveunits-variable number tandem repeat)進行基因分型鑒定，比較臨床分離株與其相應的單克隆分離株的分型結果。
　　本研究成功構建出這九種結核分枝桿菌重組蛋白，并經(jīng)測序驗證，BLAST比對相符率均為100％。構建的重組蛋白利用鎳柱進行純化，獲得了這九種結核分枝桿菌蛋白抗原的重組蛋白，經(jīng)過蛋白定量檢測，MPT64、TB10.4、HS

6、P70、HSP65、PPE68、CFP10、EspJ、EspK、Mas-1和Mas-2重組蛋白的濃度(μg/mL)分別為405.125、755.125、92.625、130.125、80.125、617.625、105.125、267.625、92.625和380.125。這為今后利用這些蛋白進行抗原的診斷效能研究和新型疫苗研究提供了基礎。
　　本研究共獲得37株臨床分離株和相應的292個單克隆分離株。其中，有8株臨床分離株分離的

7、單克隆標本數(shù)均不足5個，不適合用于多重感染的研究，故剔除。即29株臨床分離株分離的270個單克隆標本用于本研究，Spoligotyping和MIRU-VNTR分型結果顯示27株結核分枝桿菌臨床分離株與相應的單克隆分離株的分型結果一致，2株臨床分離株的單克隆分離株呈現(xiàn)了多種基因型，多重感染率為6.9％。研究結果顯示Spoligotyping和MIRU-VNTR可用于快速、有效地區(qū)分結核分枝桿菌的多重感染。同時，可結合使用具有更高分辨力的V