結(jié)核分枝桿菌Rv1096的表達及功能鑒定.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)能夠感染宿主并在宿主體內(nèi)長期存活，其細胞壁起著重要的作用。結(jié)核分枝桿菌細胞壁核心結(jié)構(gòu)由分枝菌酸、聚阿拉伯半乳糖和肽聚糖組成。肽聚糖是由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸交替連接形成的多糖鏈與短肽鏈交叉連接形成網(wǎng)狀大分子結(jié)構(gòu)，以維持細胞的形狀。結(jié)核分枝桿菌細胞壁中還含有一些蛋白質(zhì)和酶，研究細胞壁蛋白和酶有助于我們深入理解結(jié)核分枝桿菌對宿主細胞的感染機制、細菌的存活及對宿主的免

2、疫調(diào)節(jié)以及細胞壁大分子的合成與降解規(guī)律等。
　　 Rv1096是一種結(jié)核分枝桿菌細胞壁蛋白。生物信息學分析顯示，Rv1096與肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)的肽聚糖N-乙酰葡糖胺脫乙酰基酶(PgdA)具有31％(76/243)一致性。研究發(fā)現(xiàn)，由于肺炎鏈球菌PgdA對肽聚糖N-乙酰葡糖胺的脫乙酰基作用，脫乙?；碾木厶鞘辜毦軌虻挚谷芫傅慕到庾饔茫辜毦谒拗鲀?nèi)存活。在本研究中，我們將對結(jié)核分枝

3、桿菌Rv1096進行功能鑒定。
　　 目的：(1)用高保真DNA聚合酶從結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中擴增出Rv1096基因，并將其克隆到pMD18-T載體中；(2)構(gòu)建pET29b-Rv1096表達載體，在E.coli BL21(DE3)pLysS中表達結(jié)核分枝桿菌Rv1096蛋白；(3)采用親和層析技術(shù)純化Rv1096蛋白，并用SDS-PAGE以及Western blotting鑒定所純化的Rv1096蛋白；(4)對Rv10

4、96的功能進行鑒定。
　　 結(jié)果：1．克隆Rv1096基因
　　 用高保真DNA聚合酶(PrimeStar)從結(jié)核分枝桿菌H37R基因組中擴增出Rv1096基因，將純化Rv1096基因克隆到pMD18-T載體中，構(gòu)建出pMD18-Rv1096。用限制性內(nèi)切酶NdeI鑒定并進行DNA測序。
　　 2．構(gòu)建pET29b-Rv1096表達載體
　　 經(jīng)DNA測序鑒定后，將序列正確的Rv1096基因亞克隆到pET

5、29b質(zhì)粒，構(gòu)建出pET29b-Rv1096重組表達質(zhì)粒。將pET29b-Rv1096轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)pLysS菌株中。
　　 3．誘導Rv1096蛋白在E.coli BL21(DE3)pLysS中的表達用2.5mM IPTG，在18℃振蕩培養(yǎng)12小時，誘導E.coli BL21(DE3)pLysS表達重組Rv1096蛋白。用超聲法破碎細菌，對上清組分進行Western blotting分析。結(jié)果表明，在上清

6、中存在表達的Rv1096蛋白，分子量為31.08kD。
　　 4．采用親和層析技術(shù)純化Rv1096蛋白pET29b表達載體使重組Rv1096蛋白C端帶有組氨酸標簽，因此，用組氨酸-Ni2+親和層析技術(shù)對Rv1096蛋白進行純化。用Western blotting分析洗脫組分1、2，結(jié)果表明，純化所得的蛋白為Rv1096蛋白。用考馬斯亮藍法定量洗脫組分1的濃度為53.78μg/ml，該組分用于酶活性分析。
　　 5．建立脫

7、乙?；富钚缘臏y定方法將純化的Rv1096蛋白與恥垢分枝桿菌(M. smegmatis)胞壁肽底物在37℃下反應3h，用乙酸檢測試劑盒測定乙?；?。如果Rv1096具有脫乙?；富钚?，將使肽聚糖脫乙?；阴；M一步轉(zhuǎn)變成乙酸，后者與試劑盒中各組分經(jīng)過一些列的反應生成NADH+H+，在340nm處測定NADH+H+量。結(jié)果表明，Rv1096具有脫乙?；富钚?。
　　 結(jié)論：在本研究中，我們構(gòu)建了pET29b-Tb Rv1096表達