結(jié)核分枝桿菌RmlC的表達(dá)及酶活性鑒定.pdf

1、結(jié)核病(TuberculosIS,TB)是一種古老的疾病，是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，也是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題。其致病菌結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)對(duì)為數(shù)很少的治療藥物均已產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，導(dǎo)致結(jié)核病患者的死亡率顯著增加。近40年來(lái)人們一直在強(qiáng)烈地盼望新藥面市，然而卻未能如愿。因此，全球急需對(duì)付結(jié)核桿菌的有效措施，即研發(fā)有效的抗結(jié)核新藥。 藥物研發(fā)的關(guān)鍵是確定藥物作用的靶標(biāo)。

2、結(jié)核分枝桿菌具有獨(dú)特的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及生物合成和降解過(guò)程。并且細(xì)胞壁是維系分枝桿菌自身完整，生長(zhǎng)繁殖和感染宿主的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，故可作為新藥開(kāi)發(fā)的靶標(biāo)。細(xì)胞壁中二糖銜接分子(L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺)是一個(gè)重要的結(jié)構(gòu)成分，其中鼠李糖殘基的供體是dTDP-鼠李糖，而且人體中不存在鼠李糖，因此，參與dTDP-鼠李糖合成的dTDP-鼠李糖合成酶系(RmlA，RmlB，RmlC和RmlD)是重要的研發(fā)新的抗結(jié)核藥的靶標(biāo)，抑制RmlA，RmlB，

3、RmlC或RmlD酶的抑制劑，均可能成為新的抗結(jié)核藥。 RmlC酶，即dTDP-4-酮基-6-脫氧-D-葡萄糖3，5表異構(gòu)酶，由rmlC基因所編碼。最近的研究結(jié)果表明，rmlC基因是分枝桿菌生長(zhǎng)必需基因。 為了建立體外篩選RmlC酶抑制劑的分子模型，我們需要獲得高純度的RmlC酶蛋白，并為建立快速、精確的酶活性測(cè)定方法和研究酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特性提供物質(zhì)保障。我們實(shí)驗(yàn)室已克隆了rmlC基因并構(gòu)建了在大腸桿菌中高表達(dá)rmlC基

4、因的表達(dá)載體，在本研究中，我們將優(yōu)化rmlC基因在大腸桿菌中的表達(dá)條件，以期獲得可溶性RmlC酶蛋白。 同時(shí)，我們將建立體內(nèi)篩選RmlC酶抑制劑的模型，以確定用分子模型篩選到的RmlC酶抑制劑，最終是否抑制分枝桿菌中的RmlC酶。在本研究中，我們將構(gòu)建在分枝桿菌中高表達(dá)rmlC基因的表達(dá)載體，并篩選高表達(dá)RmlC酶蛋白的分枝桿菌菌株。 本論文的目標(biāo)是：1.優(yōu)化RmlC酶蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)條件(1)將構(gòu)建的表達(dá)載體pE

5、T16b-TbrmlC和pET23b-TbrmlC轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，優(yōu)化RmlC酶蛋白的表達(dá)條件，以提高可溶性RmlC酶蛋白的產(chǎn)量。(2)用親和層析法純化RmlC酶蛋白，并用WesternBlot方法鑒定RmlC酶蛋白。(3)測(cè)定純化的RmlC酶蛋白的酶活性。 2.建立高表達(dá)RmlC酶蛋白的分枝桿菌菌株(1)用PCR方法從結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株的基因組DNA中擴(kuò)增rmlC基因。(2)構(gòu)建在分枝桿菌中高表達(dá)rmlC基因的表達(dá)載

6、體。(3)測(cè)定RmlC酶蛋白在分枝桿菌中的酶活性。 本論文所獲得的結(jié)果如下：1.優(yōu)化RmlC酶蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)條件1)利用pET16b表達(dá)載體在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)RmlC酶蛋白。 將pET16b-TbrmlC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。在不同條件(IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時(shí)間等)下誘導(dǎo)RmlC的表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，rmlC基因在BL21(DE3)中表達(dá)出可溶性RmlC

7、蛋白質(zhì)。 2)利用pET23b表達(dá)載體在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)RmlC酶蛋白。 (1)將pET23b-TbrmlC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。在不同條件(IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時(shí)間等)下誘導(dǎo)RmlC的表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明RmlC蛋白質(zhì)在BL21(DE3)中得以表達(dá)，但以包涵體形式存在。 (2)RmlC蛋白質(zhì)與分子伴侶共表達(dá)體系的建立及RmlC蛋白質(zhì)的優(yōu)化表達(dá) 將

8、攜帶分子伴侶的pKJE7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，再用pET23b-TbrmlC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)/pKJE7感受態(tài)細(xì)胞。在不同條件(L-阿拉伯糖及IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)溫度等)下誘導(dǎo)分子伴侶和RmlC蛋白質(zhì)的共表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明rmlC基因在BL21(DE3)/pKJE7中表達(dá)出可溶性RmlC蛋白質(zhì)。 3)RmlC蛋白質(zhì)的純化和鑒定用Ni-NTA親和層析方法純化RmlC蛋白質(zhì)，用抗

9、多聚組氨酸的單克隆抗體及偶聯(lián)堿性磷酸酶的馬抗小鼠IgG二抗進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，純化的RmlC蛋白質(zhì)為rmlC基因產(chǎn)物。 4)酶活性測(cè)定將純化的RmlC蛋白質(zhì)與底物dTDP-glucose、純化的RmlB和RmlD在30℃孵育30分鐘。用HPLC方法測(cè)定dTDP-glucose轉(zhuǎn)化為dTDP-rhamnose的轉(zhuǎn)化率，以表示RmlC酶活性。結(jié)果顯示RmlC蛋白質(zhì)具有酶活性。 2.建立高表達(dá)RmlC酶蛋白的分枝桿菌菌株我們選

10、擇具有與結(jié)核分枝桿菌相同的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)并生長(zhǎng)速度快且無(wú)病原性的恥垢分枝桿菌(Mycobateriumsmegmatis)mc2155菌株作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?(1)rmlC基因的擴(kuò)增用PCR技術(shù)從結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中擴(kuò)增了rmlC基因。由于在rmlC基因的上游引物及下游引物中分別引入了NdeⅠ及HindⅢ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，所以在rmlCPCR產(chǎn)物的兩端分別攜帶NdeⅠ及HindⅢ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。 (2)rmlC基因的

11、克隆和DNA序列測(cè)定將純化的rmlCPCR產(chǎn)物克隆到pSTBlue1載體，構(gòu)建出pSTBlue-TbrmlC質(zhì)粒。用Multalin(http：//prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)對(duì)rmlC基因的DNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)所克隆的rmlC基因與H37Rv基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中rmlC基因的DNA序列完全一致，經(jīng)PCR擴(kuò)增的rmlC基因不存在任何堿基突變。 (3

12、)表達(dá)載體的構(gòu)建用NdeⅠ和HindⅢ雙酶切陽(yáng)性重組質(zhì)粒pSTBlue-TbrmlC，將rmlC基因連接到pVV16載體的NdeⅠ和HindⅢ位點(diǎn)，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pVV16-TbrmlC。 (4)RmlC蛋白質(zhì)的表達(dá)將pVV16-TbrmlC電轉(zhuǎn)化到恥垢分枝桿菌mc2155菌株中，在37℃條件下表達(dá)RmlC蛋白質(zhì)。 (5)RmlC蛋白質(zhì)的酶活性測(cè)定將mc2155/pVV16-TbrmlC的上清液(即粗酶)與底物dTDP-

13、glucose和純化的RmlB和RmlD混勻，在30℃孵育30分鐘，用HPLC方法測(cè)定dTDP-glucose轉(zhuǎn)化為dTDP-rhamnose的轉(zhuǎn)化率，以表示RmlC酶活性。結(jié)果顯示，rmlC基因在mc2155中表達(dá)出RmlC酶蛋白。 結(jié)論：在本研究中，我們以pET16b和pET23b作為表達(dá)載體，在大腸桿菌中成功地表達(dá)出大量的可溶性結(jié)核分枝桿菌RmlC蛋白質(zhì)，為完善RmlC酶活性測(cè)定方法、研究純RmlC酶的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特性和