結(jié)核分枝桿菌預(yù)苯酸脫氫酶的酶學研究.pdf

1、復(fù)旦大學碩士學位論文結(jié)核分枝桿菌預(yù)苯酸脫氫酶的酶學研究姓名：徐勝鳳申請學位級別：碩士專業(yè)：微生物學指導(dǎo)教師：王洪海20070515摘要結(jié)核病已經(jīng)成為全球性的健康問題，其治病率和死亡率逐年增加。近年來，由于結(jié)核病的致病菌結(jié)核桿菌的多耐菌株的出現(xiàn)，以及結(jié)核桿菌和H I V 病毒之間的協(xié)同作用，結(jié)核病的情況日益嚴竣。迫切需要新的抗結(jié)核藥物以縮短治療時間和應(yīng)對上述出現(xiàn)的問題。芳香族氨基酸的合成途徑不存在于哺乳動物中，它們由食物中攝取這些必需氨基

2、酸。然而，對于藻類、細菌、真菌和高等植物，它們必需自行合成芳香族氨基酸。這種高度選擇性使得芳香族氨基酸合成途徑中的酶成為可能的開發(fā)有效抗結(jié)核藥物的藥靶。酪氨酸合成途徑是莽草酸途徑的一個分支。而預(yù)苯酸脫氫酶( P D H ) 則是酪氨酸合成途徑中的第二個酶，催化分支酸合成對羥苯丙酮酸，這一反應(yīng)過程中N A D + 是輔酶。本實驗對預(yù)苯酸脫氫酶的酶學特性進行了研究。重組的結(jié)核桿菌預(yù)苯酸脫氫酶( H i s ．r M t P D H ) 在大

3、腸桿菌B L 2 1 ( D E 3 ) 中進行表達，通過親和純化獲得高純的重組蛋白，H P L C 和質(zhì)譜證明所得的確為重組目的蛋白。同時通過腸激酶得到切除其N 端H i s - t a g 的重組P D H 。通過測試p I - I ，溫度和N a + 陽離子對酶活反應(yīng)的影響確定了最優(yōu)的反應(yīng)條件。在此反應(yīng)條件下，獲得該酶對底物預(yù)苯酸和N A D + 的各項酶學參數(shù)。實驗中發(fā)現(xiàn)N 端H i s - t a g 對酶活性的影響很小。另外