結(jié)核分枝桿菌螺旋酶與DNA的相互作用研究.pdf

1、DNA螺旋酶(EC 5.99.1.3)是原核生物細(xì)胞存活所必需的，也是許多抗癌藥物和抗生素藥物的作用靶標(biāo)，并已在探討生命活動機(jī)理和開發(fā)設(shè)計新型藥物等方面成為研究熱點。目前全世界特別是我國的結(jié)核菌感染十分嚴(yán)重，結(jié)核病已成為人類的主要傳染性殺手，而結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的致病菌。DNA螺旋酶參與了結(jié)核分枝桿菌的基本生命活動過程，是結(jié)核病菌產(chǎn)生耐藥性的主要因素之一，也是結(jié)核分枝桿菌中唯一的一種類型Ⅱ拓?fù)洚悩?gòu)酶。開展結(jié)核分枝桿菌螺旋酶的研究，無疑

2、在理論和應(yīng)用上均具有重要的意義。 通過采用生物信息學(xué)軟件、分子克隆、凝膠排阻電泳和SPR儀等手段進(jìn)行研究，結(jié)果表明結(jié)核分枝桿菌螺旋酶的基因富含GC，所編碼的蛋白具有氨基酸偏愛性，獲得了具酶活性的結(jié)核分枝桿菌螺旋酶重組酶。結(jié)核分枝桿菌螺旋酶GyrB亞基更是一種單鏈DNA結(jié)合蛋白，而GyrA和重組酶A<,2>B<,2> 可結(jié)合單鏈和雙鏈 DNA，但GyrA-NTD和GyrA-CTD只能結(jié)合具特異親和位點的雙鏈DNA。發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌

3、螺旋酶及其亞基結(jié)合DNA不依賴于鎂離子，在30℃等結(jié)合條件時有利于GyrA亞基結(jié)合雙鏈DNA，但鈣離子、EDTA或諾氟沙星存在時會阻礙GyrA結(jié)合雙鏈DNA。結(jié)核分枝桿菌螺旋酶GyrA與Pyrobest Polymerase、BSA等具有相似的DNA結(jié)合活性，能結(jié)合不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的DNA，而且能結(jié)合小到36 bp的DNA片段。證實Y577、R691和R745是結(jié)核分枝桿菌螺旋酶GyrA-CTD中關(guān)鍵的DNA結(jié)合活性位點，GyrA-CTD中

4、第三個片狀結(jié)構(gòu)是結(jié)核分枝桿菌螺旋酶主要的DNA結(jié)合區(qū)域，提出結(jié)核分枝桿菌GyrA-CTD可作為一個新的藥靶。發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌螺旋酶耐藥雙突變體比野生型的具有更高的單鏈和雙鏈DNA結(jié)合活性，據(jù)此提出了耐藥雙突變株耐藥機(jī)理和諾氟沙星殺菌機(jī)理的假說。 這是首次發(fā)現(xiàn)DNA螺旋酶GyrB亞基能結(jié)合DNA，首次對螺旋酶GyrA-CTD內(nèi)的DNA結(jié)合位點進(jìn)行鑒定，首次發(fā)現(xiàn)GyrA-CTD能影響螺旋酶的松弛活性，也是首次發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌螺旋酶耐