NK細胞在結核分枝桿菌中的抗感染作用.pdf

1、研究背景：中性粒細胞（PMN）和自然殺傷細胞（NK）是重要的天然免疫細胞。天然免疫細胞在抗結核感染中受到更多關注，而 PMN,NK細胞在結核感染中的作用卻一直很少被注意到。近年來研究發(fā)現，PMN NK細胞這一具有天然免疫作用的細胞可能也參與抗結核感染的免疫保護作用，但PMN在抗結核感染的免疫保護作用中的確切機制尚未明確。探討PMN NK細胞在抗結核感染的天然免疫作用的具體作用機理，以及與γδT細胞在抗結核感染中的相互調節(jié)作用,對全面了解

2、結核病的發(fā)病機制和機體抗結核感染的免疫保護機制，具有重要的理論意義和臨床應用價值。
　　目的：檢測和比較初治和復治結核病患者與健康人外周血NK細胞的數量和胞內殺傷分子的變化。并且通過檢測健康人和肺結核患者外周血NK細胞的細胞因子的表達，PMN細胞和γδT細胞共培養(yǎng)產生IL17、IFN-γ的變化，探討NK細胞，PMN細胞在結核感染中的作用和意義。
　　方法：1.取健康人（112例）和結核病患者外周血145例（初治105例，復治

3、40例）?？鼓庵苋獦吮?，加熒光抗體 CD3APC,CD56PE,CD8PECY5.5染色，溶血洗滌后在流式細胞儀檢測。分析采用BD公司cellquest軟件。在FSC-SSC點陣圖上設定淋巴細胞 R1，再以 R1設門（G1），在 CD3和 CD56點陣圖上作四分法（Quadrants）劃區(qū)，以CD3-CD56+區(qū)為NK細胞區(qū)，計算在淋巴細胞中的百分率。同時每份外周血標本在 GT-1200全自動血液分析儀上以血常規(guī)分析方法對白細胞作三

4、分類（即粒細胞，淋巴細胞，單核細胞）計數檢測，獲得淋巴細胞絕對數，再與流式檢測的NK細胞的百分比相乘計算獲得NK細胞的絕對數。
　　2.檢測胞內殺傷分子的染色檢查在表染后作固定透膜處理，再加抗顆粒溶解素，抗顆粒酶和抗穿孔素熒光抗體染色，透膜洗滌后再上流式儀檢測分析。
　　3．采集22例活動性肺結核病人和18例HD外周血，加入佛波醇酯（PMA）和鈣離子霉素（Ionomycin）刺激培養(yǎng)2小時后，再加入莫能霉素（Monensin

5、）繼續(xù)培養(yǎng)4小時，收集細胞，加入熒光標記抗體CD3APC,CD56PE進行表面分子染色，透膜后再加細胞因子熒光標記單抗抗 IL17IL22和抗 IFN-γ TNF-α作細胞內染色，流式細胞儀檢測分泌IL-22 IL-17和IFN-γ TNF-α的淋巴細胞亞群的比例。
　　4.取9例健康外周血各10ml采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（PBMC），加入 Mtb-HAg和 rIL-2刺激培養(yǎng)7-10天后，使其成為富含效應性γδ

6、T細胞的Mtb-HAg激活的T細胞（Mtb-AT），然后和 PMN共培養(yǎng)24h，收集細胞用PMA/Ionomycin和Monensin以及Mtb-HAg和Monensin刺激培養(yǎng)6小時，用流式細胞儀檢測γδT分泌IL-17和IFN-γ的比例。
　　5.取10例健康外周血各10ml，分離獲得PBMC,用含5％NBS培養(yǎng)液RPM11640配成細胞懸液濃度為1.5×106∕ml，在24孔培養(yǎng)板上種5孔分別加入IL2、MTB-Ag、HDM

7、APP、MTB-Ag+IL2、HDMAPP+IL2處理，在0h，12h，36，48h，72h后染抗CD3-CD56+，然后檢測各孔NK細胞的CD69，CD25的變化。
　　結果:
　　1.初治肺結核患者外周血淋巴細胞中 NK細胞的比例(16.95±8.27)%顯著低于健康組(19.99±9.28)%和復治組(20.59±7.99)%。
　　2.健康人組（88例）外周血NK細胞絕對值計數為（44.32±26.69）×10

8、4∕ml，結核初治組（90例）為（33.31±21.44）×104∕ml，復治組（33例）為（36.8±24.97）×104∕ml。結核初治組明顯低于正常組（p＜0.05）。
　　3.結核病患者NK細胞中表達顆粒溶解素(85.78±11.63)%，穿孔素（82.88±17.05）%和顆粒酶（79.07±15.64）%和健康人組(87.31±10.34)%,(82.85±13.03)%和(88.04±7.27)%無明顯差異。而結核病

9、組CD8+T細胞中表達顆粒溶解素(28.42±16.27)%，顆粒酶（40.03±16.69）%，穿孔素（15.12±16.31）%和正常組差異不明顯。
　　4.健康人外周血NK細胞中表達IL17(21例)(1.41±1.42)%，IFN-γ(21例)(26.99±2.38)%，IL22(21例)(0.51±0.36)%，TNF-α(11例)(2.29±1.77)%和肺結核患者外周血NK細胞中產生IL17(22例)(2.78±2.

10、65)%，IFN-γ(20例)(37.07±3.1)%，IL22(18例)(1.61±1.46)%，TNF-α(15例)(4.08±2.17)%的比較，P均＜0.05，并且肺結核患者表達的IL17、IL22、TNF-α、IFN-γ增高。
　　5.將γδT細胞和PMN分成六個處理組,各組分別產生的IL17為IL2(1.13±0.36)%、MTB-Ag(1.28±0.47)%、HDMAPP(0.76±0.86)%、IL2+PMN(0.

11、98±0.58)%、MTB-Ag+PMN(0.99±0.49)%、HDMAPP+PMN(0.94±0.93)%,這六個處理組產生IL17沒有顯著性差異。各組分別產生的IFN-γ為IL2(39.6±14.52)%、MTB-Ag(56.55±10.5)%、 HDMAPP(49.15±14.33)%、 IL2+PMN(39.11±12.78)%、MTB-Ag+PMN(41.51±9.48)%、HDMAPP+PMN(51.11±14.88)%，

12、加入PMN對γδT細胞在MTB-Ag和MTB-Ag+PMN處理組中產生IFN-γ有影響， P＜0.05，且在MTB-Ag加入PMN后產生IFN-γ減少。
　　6.將PBMC分別加入IL2、MTB-Ag、HDMAPP、MTB-Ag+IL2、HDMAPP+IL2分為5組處理，NK細胞的CD69在MTB-Ag+IL2處理組中在12h達到高峰。NK細胞的CD25在MTB-Ag處理組中在48h達到高峰。
　　結論：
　　1.結核