腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌感染的分子機(jī)制及結(jié)核分枝桿菌跨越血腦屏障體外模型的初步研究.pdf

1、結(jié)核性腦膜炎主要由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起，是結(jié)核病最嚴(yán)重的一種形式，主要發(fā)生于幼兒和HIV感染病人，具有高致死率的特點(diǎn)。結(jié)核性腦膜炎的發(fā)生是由于結(jié)核分枝桿菌隨血液循環(huán)到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)所致，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的血腦屏障保護(hù)。盡管體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究均表明結(jié)核分枝桿菌可以跨越血腦屏障。但是，結(jié)核分枝桿菌跨越血腦屏障的細(xì)胞和分子機(jī)制仍然不清楚。
　　本研究以分枝桿

2、菌為研究對(duì)象，以腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞為模型，通過(guò)研究分枝桿菌與細(xì)胞相互作用及構(gòu)建血腦屏障體外模型，以期解釋腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞在抗分枝桿菌感染在中的作用及分枝桿菌跨越血腦屏障的機(jī)制。主要內(nèi)容如下:
　　1.分枝桿菌感染鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的受體分析。為了研究CD44在分枝桿菌感染鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用，我們分別用牛分枝桿菌BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染細(xì)胞，在特定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行透射電子顯微鏡，激光共聚焦掃描顯微鏡和流式細(xì)胞儀器檢測(cè)及采用

3、CD44中和抗體進(jìn)行阻斷分析。透射電子顯微鏡結(jié)果顯示牛分枝桿菌BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv均可感染并內(nèi)化到鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞吞噬泡內(nèi)，并且二者之間沒(méi)有顯著性差異。激光共聚焦掃描顯微鏡結(jié)果顯示CD44表達(dá)在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)也有少量的CD44表達(dá)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)CD44可以募集到分枝桿菌感染位點(diǎn)，但是，CD44的表達(dá)不受分枝桿菌感染的影響。然而，CD44中和抗體不能阻斷分枝桿菌感染并內(nèi)化到鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)。以上結(jié)果說(shuō)明

4、分枝桿菌可以感染并內(nèi)化到鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，但CD44不參與這一過(guò)程。
　　2.分枝桿菌在鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中存活的分析。為了研究分枝桿菌是否在鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中繁殖，我們分別用牛分枝桿菌BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染細(xì)胞，在特定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行胞內(nèi)存活實(shí)驗(yàn)及顯微鏡計(jì)數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在無(wú)抗生素的條件下結(jié)合及內(nèi)化到細(xì)胞內(nèi)的牛分枝桿菌BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv數(shù)量先降低而后升高，但當(dāng)在抗生素存在的條件下二者在細(xì)胞內(nèi)的活菌數(shù)量呈現(xiàn)顯著性

5、下降的趨勢(shì)。在不同時(shí)間點(diǎn)取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)在無(wú)抗生素的條件下牛分枝桿菌BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv均可在培養(yǎng)上清中繁殖，但是在抗生素存在條件下則檢測(cè)不到活菌的存在。此外，我們也用顯微鏡計(jì)數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在抗生素存在情況下，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞感染的百分比，包含10個(gè)以上細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)及細(xì)菌總數(shù)均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。以上結(jié)果說(shuō)明牛分枝桿菌BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv不能在鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中繁殖。
　　3.分枝

6、桿菌感染對(duì)鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。為了研究是否分枝桿菌感染對(duì)鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性效應(yīng)，我們用牛分枝桿菌BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染細(xì)胞，在不同的時(shí)間點(diǎn)固定細(xì)胞進(jìn)行顯微鏡觀察，測(cè)定LDH及統(tǒng)計(jì)臺(tái)盼蘭陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛分枝桿菌BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染及在細(xì)胞中的持續(xù)存在均不破壞鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)。另外，感染細(xì)胞LDH的釋放量及臺(tái)盼蘭陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量也沒(méi)有顯著性上升。說(shuō)明分枝桿菌感染和持續(xù)存在不

7、對(duì)鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性效應(yīng)。
　　4.分枝桿菌在鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的運(yùn)輸分析。為了研究是否分枝桿菌被鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞降解，從而不能在該細(xì)胞中繁殖。我們分別用牛分枝桿菌BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，并用吞噬體特異性分子，Rab5和Rab7，及溶酶體特異性分子，LAMP2和Cathepsin L細(xì)胞并進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛分枝桿菌BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv吞噬體均可以被Rab5，

8、Rab7，LAMP2和Cathepsin L分別標(biāo)記，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)被Rab5標(biāo)記的吞噬體的數(shù)量顯著性降低，被Rab7和LAMP2共同標(biāo)記的吞噬體則顯著性上升，說(shuō)明包含分枝桿菌的吞噬體成熟為吞噬溶酶體。另外，牛分枝桿菌BCG可以被Cathepsin L強(qiáng)標(biāo)記，但是結(jié)核分枝桿菌H37Rv則不能，說(shuō)明后者可以延緩?fù)淌扇苊阁w的酸化。以上結(jié)果說(shuō)明分枝桿菌吞噬體成熟為吞噬溶酶體，進(jìn)而被細(xì)胞降解。
　　5.分枝桿菌逃逸到鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞

9、質(zhì)的分析。為了研究分枝桿菌是否可以逃逸到細(xì)胞質(zhì)，從而躲避腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的快速殺傷作用，我們用SpiOC18和Phalloidin共同標(biāo)記細(xì)胞后進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一定數(shù)量的結(jié)核分枝桿菌H37Rv不能被SpiOC18進(jìn)行標(biāo)記，而牛分枝桿菌BCG則不能，說(shuō)明該毒力菌株具有逃逸到細(xì)胞質(zhì)的能力。最后，我們檢測(cè)了結(jié)核分枝桿菌H37Rv是否可以逃出細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)沒(méi)有抗生素的情況下牛分枝桿菌BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染細(xì)胞可以

10、形成菌落簇，而當(dāng)抗生素存在的情況下菌落簇則消失，說(shuō)明二者均不能逃出細(xì)胞。以上結(jié)果說(shuō)明結(jié)核分枝桿菌H37Rv通過(guò)逃逸到細(xì)胞質(zhì)而逃避細(xì)胞的快速殺傷作用，但是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)菌則不能逃出細(xì)胞。
　　6.分枝桿菌在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人星形膠質(zhì)細(xì)胞中的存活分析。為了研究分枝桿菌是否在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人星形膠質(zhì)細(xì)胞中繁殖，我們分別用牛分枝桿菌BCG和結(jié)核分枝桿菌毒力菌株H37Rv感染細(xì)胞，在特定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行胞內(nèi)存活實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在抗生素存在的

11、條件下，人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的分枝桿菌活菌數(shù)量呈現(xiàn)顯著性下降的趨勢(shì)。此外，我們發(fā)現(xiàn)二者也不能逃出細(xì)胞并感染臨近細(xì)胞。以上的結(jié)果說(shuō)明分枝桿菌不能在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人星形膠質(zhì)細(xì)胞中繁殖，同時(shí)也不能逃出感染細(xì)胞。
　　7.分枝桿菌跨越血腦屏障雙層細(xì)胞模型的分析。為了研究是否分枝桿菌跨越血腦屏障通過(guò)細(xì)胞間隙途徑及外周血單核細(xì)胞在分枝桿菌跨越血腦屏障中的作用，我們用人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人星形膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建了血腦屏障體外模型

12、，分別用游離的分枝桿菌和感染了分枝桿菌的巨噬細(xì)胞感染血腦屏障體外模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌毒力菌株H37Rv可以跨越該血腦屏障體外模型，同時(shí)，伴隨著該屏障結(jié)構(gòu)通透性的改變，表現(xiàn)為T(mén)EER的顯著性降低和對(duì)Na-F通透性的增強(qiáng)。然而，牛分枝桿菌BCG則不能跨越該屏障結(jié)構(gòu)。有意思的是，包含細(xì)菌的巨噬細(xì)胞感染血腦屏障后可以引起通透性的改變，但是只有毒力菌株可以跨越血腦屏障。
　　以上結(jié)果說(shuō)明結(jié)核分枝桿菌跨越血腦屏障可能通過(guò)細(xì)胞間隙并伴隨著