結(jié)核分枝桿菌干擾巨噬細(xì)胞自噬的初步研究.pdf

1、由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）引起的結(jié)核病是世界上最嚴(yán)重的細(xì)菌性疾病之一。盡管宿主細(xì)胞存在著多種清除結(jié)核分枝桿菌的策略，但結(jié)核分枝桿菌也進(jìn)化出了對抗宿主細(xì)胞殺傷作用的生存機(jī)制。研究表明，細(xì)胞自噬與結(jié)核分枝桿菌的相互斗爭，是影響該菌能否在宿主細(xì)胞中生存的重要因素。然而，參與這一過程的細(xì)菌和宿主相關(guān)基因仍未得到詳細(xì)的闡釋。
　　本研究以結(jié)核分枝桿菌作為研究對象，通過構(gòu)建青色或藍(lán)色熒光表

2、達(dá)菌株和雙熒光指示自噬的巨噬細(xì)胞系以及一套能夠抑制和激活真核基因表達(dá)的CRISPRi/CRISPRa系統(tǒng)作為研究工具，以此來揭示調(diào)控結(jié)核分枝桿菌在宿主細(xì)胞中存活的相關(guān)基因。主要研究內(nèi)容如下:
　　1.青色/藍(lán)色熒光結(jié)核分枝桿菌H37Ra的構(gòu)建。為了方便利用熒光顯微鏡對結(jié)核分枝桿菌的直接觀察，我們將能夠表達(dá)青色或者藍(lán)色熒光蛋白的pMV261-CFP/BFP質(zhì)粒導(dǎo)入到結(jié)核分枝桿菌H37Ra中。通過篩選，得到了能夠穩(wěn)定表達(dá)青色或藍(lán)色熒光

3、的結(jié)核分枝桿菌。
　　2.雙熒光指示自噬的巨噬細(xì)胞系的構(gòu)建。首先，我們將EGFP基因突變?yōu)镚FPph使其對pH環(huán)境更加敏感，并與mCherry和LC3基因進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)。之后，利用CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)，將GFPph-mCherry-LC3融合基因插入到Raw264.7細(xì)胞基因組中。通過多輪的挑斑篩選以及流式技術(shù)的純化，我們獲得了高陽性率的GphML-Raw264.7細(xì)胞。通過對基因組的測序以及Western Blot技術(shù)

4、驗(yàn)證相關(guān)蛋白的表達(dá)，確認(rèn)細(xì)胞系的構(gòu)建成功。最后，利用自噬誘導(dǎo)劑進(jìn)行驗(yàn)證，確認(rèn)該細(xì)胞系可以有效地指示自噬的發(fā)生。
　　3.結(jié)核分枝桿菌蛋白對自噬干擾的分析。為了探究哪些細(xì)菌蛋白通過干預(yù)自噬而參與調(diào)控結(jié)核分枝桿菌長期潛伏于巨噬細(xì)胞，我們將經(jīng)過密碼子優(yōu)化的33個結(jié)核相關(guān)蛋白與GphML-Raw264.7細(xì)胞進(jìn)行共孵育，通過雷帕霉素誘導(dǎo)自噬發(fā)生，在特定時間點(diǎn)利用激光共聚焦顯微鏡分析自噬的發(fā)生狀況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rv0847處理細(xì)胞中綠色熒光點(diǎn)與

5、紅色熒光點(diǎn)可以共定位，說明Rv0847可以干擾自噬體與溶酶體的融合。以上結(jié)果說明Rv0847可能干擾自噬溶酶體的融合，從而參與結(jié)核分枝桿菌在細(xì)胞內(nèi)的存活。
　　4.宿主自噬基因gRNA文庫的構(gòu)建。利用CRISPRi/CRISPRa技術(shù)，我們可以在真核細(xì)胞基因組上抑制或者激活基因的表達(dá)。我們將該系統(tǒng)及相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，結(jié)果顯示其可有效地激活或者抑制相關(guān)基因的表達(dá)。之后，我們篩選了所有參與到自噬過程中的相關(guān)基因，并通過NCBI