結(jié)核分枝桿菌ESX-1分泌蛋白調(diào)控巨噬細(xì)胞功能的研究.pdf

1、近些年研究證實(shí),ESX-1蛋白分泌系統(tǒng)與結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞中存活、生長(zhǎng)繁殖及致病密切相關(guān),是結(jié)核分枝桿菌的一個(gè)重要毒力因子?，F(xiàn)已確認(rèn),ESX-1系統(tǒng)可分泌多個(gè)結(jié)核分枝桿菌蛋白,這些分泌蛋白存在共分泌現(xiàn)象,缺失其中某種蛋白就會(huì)影響其他蛋白的分泌,同時(shí)導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌毒力及致病性的顯著下降,因此通過基因敲除和過表達(dá)去單獨(dú)研究某一種ESX-1分泌蛋白功能比較困難。目前,對(duì)于每一種ESX-1蛋白是否直接參與了結(jié)核分枝桿菌的致病過程以及參與致

2、病的分子機(jī)理是什么還不太清楚或存在不同的觀點(diǎn)。本文主要以兩個(gè)ESX-1分泌蛋白ESAT-6和EspB為研究對(duì)象,以建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系和重組BCG為主要手段,來考察這兩個(gè)蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能、細(xì)胞凋亡和吞噬體成熟的影響,分析其調(diào)控機(jī)理,探討它們?cè)诮Y(jié)核分枝桿菌致病過程中的地位和所起的作用,從而加深對(duì)ESX-1分泌系統(tǒng)致病機(jī)理的了解,為研制結(jié)核病治療藥物和新型疫苗提供新的靶點(diǎn)。
　　首先,構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)ESAT-6和EspB的系列小鼠巨噬

3、細(xì)胞系。國(guó)外研究顯示,EspB在從結(jié)核分枝桿菌分泌到菌體外過程中,會(huì)被周質(zhì)腔MycP1酶裂解,只有其N端(EspBN)會(huì)分泌至菌體外,可能與巨噬細(xì)胞相互作用。前期研究中,我們?cè)謩e建立與綠色熒光蛋白EGFP融合表達(dá)的ESAT-6和EspB穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系RAW-E6和RAW-EspB。本研究以表達(dá)EGFP-EspB融合蛋白的質(zhì)粒為模板,通過反向PCR技術(shù),構(gòu)建了表達(dá)EGFP-EspBN融合蛋白的pEGFP-EspBN重組質(zhì)粒。利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的

4、方法,把該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠RAW264.7細(xì)胞系中,經(jīng)G418篩選,及在基因水平、轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平鑒定,獲得了穩(wěn)定表達(dá)EGFP-EspBN的RAW-EspBN巨噬細(xì)胞系?？紤]到EGFP是一個(gè)分子量較大的蛋白,與其融合表達(dá)會(huì)否影響ESAT-6和EspB的結(jié)構(gòu)與功能還不清楚,所以我們又構(gòu)建了小分子量標(biāo)簽flag與ESAT-6和EspBN融合表達(dá)的巨噬細(xì)胞系。在原有表達(dá)質(zhì)?；A(chǔ)上,通過反向PCR技術(shù),構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pFLAG-ES

5、AT-6、pFLAG-EspBN和pFLAG-EGFP,經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染、篩選與鑒定,獲得了穩(wěn)定表達(dá)flag-ESAT-6、flag-EspBN和flag-EGFP融合蛋白的巨噬細(xì)胞系RAW-flag-E6、RAW-flag-EspBN和RAW-flag-EGFP。通過western blot分析了穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中目標(biāo)蛋白表達(dá)定位情況,發(fā)現(xiàn)EGFP-EspBN和flag-EspBN在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上均有分布,flag-ESAT-6與flag-EG

6、FP主要表達(dá)于RAW264.7細(xì)胞質(zhì)中。這一系列細(xì)胞系的建立為研究ESAT-6和EspB對(duì)巨噬細(xì)胞功能的調(diào)控作用,以及它們與巨噬細(xì)胞相互作用的分子機(jī)理提供了研究工具。
　　其次,構(gòu)建了表達(dá)ESAT-6和EspB的系列重組BCG。BCG是減毒的牛分枝桿菌,是唯一上市的結(jié)核疫苗,其基因組中沒有RD-1區(qū),不能表達(dá)ESAT-6,雖能表達(dá)EspB但不能分泌。因此,為排除ESX-1共分泌系統(tǒng)其他蛋白的干擾,我們研究ESAT-6與EspB生物

7、功能的另外一個(gè)策略就是構(gòu)建分泌表達(dá)ESAT-6和EspBN的重組BCG(rBCG)。將ESAT-6基因與sESAT-6基因(帶Ag85B信號(hào)肽序列)分別克隆進(jìn)穿梭質(zhì)粒pLYG206中,構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pLYG-ESAT-6和pLYG-SESAT-6。通過電轉(zhuǎn)化的方法,把這兩個(gè)表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入BCG,經(jīng)zeocin抗生素篩選,菌落PCR鑒定與western blot分析,分別獲得胞內(nèi)表達(dá)ESAT-6的rBCG-E6和分泌表達(dá)ESAT-6的r

8、BCG-SE6。將EspB與EspBN基因克隆進(jìn)pLYG206,構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pLYG-EspB和pLYG-EspBN。通過轉(zhuǎn)化、篩選與鑒定,分別獲得表達(dá)EspB的rBCG-EB和表達(dá)EspBN的rBCG-EN。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),rBCG-EN能夠以一種未知的方式分泌表達(dá)EspBN至菌體外,而rBCG-EB只能夠在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)EspB。系列重組BCG的獲得為建立結(jié)核分枝桿菌的感染模型,探討ESX-1分泌蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用,以及構(gòu)建新型

9、疫苗提供了基礎(chǔ)。
　　研究了ESAT-6對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。吞噬功能是巨噬細(xì)胞對(duì)抗病原入侵的早期防御性反應(yīng),而ESAT-6作為結(jié)核分枝桿菌早期分泌的毒力蛋白已被證實(shí)通過多種途徑調(diào)控巨噬細(xì)胞功能。因此我們推測(cè)ESAT-6可能也會(huì)影響巨噬細(xì)胞的吞噬功能,并分別以穩(wěn)轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞系、重組蛋白處理巨噬細(xì)胞和重組BCG感染巨噬細(xì)胞三種方式考察了ESAT-6對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。
　　一、通過流式細(xì)胞儀、共聚焦顯微鏡和菌落計(jì)數(shù)等方

10、法分析顯示,穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系RAW-E6(表達(dá)EGFP-ESAT-6融合蛋白)和RAW-flag-E6(表達(dá)flag-ESAT-6融合蛋白)吞噬熒光微球及E.coli的能力明顯增強(qiáng)。
　　二、經(jīng)流式細(xì)胞儀分析,重組ESAT-6蛋白處理的RAW264.7細(xì)胞顯示出吞噬熒光微球的能力增強(qiáng)。
　　三、類似方法分析顯示,rBCG-SE6感染RAW264.7細(xì)胞可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能,而rBCG-E6對(duì)吞噬功能無顯著影響。這些結(jié)果均說明了

11、ESAT-6能夠增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能。進(jìn)一步,我們對(duì)可能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能的因素p38、IL-12和ESAT-6膜穿孔作用進(jìn)行了考察,結(jié)果顯示ESAT-6增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能不依賴于p38途徑和細(xì)胞因子IL-12,而是可能與ESAT-6的膜穿孔作用有關(guān)。
　　研究了ESAT-6對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的影響。許多研究報(bào)道,結(jié)核分枝桿菌能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞以及上皮細(xì)胞的凋亡,但其誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的成分和對(duì)誘導(dǎo)凋亡機(jī)理的解釋各不相同。為了解

12、ESAT-6在這一過程中的作用及探討可能的分子機(jī)理,本研究通過流式細(xì)胞術(shù)分別考察了穩(wěn)轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞系、重組蛋白處理的巨噬細(xì)胞和重組BCG感染的巨噬細(xì)胞的凋亡情況。
　　一、發(fā)現(xiàn)RAW-E6只有在培養(yǎng)48h后才能夠表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞凋亡增強(qiáng),培養(yǎng)24h時(shí)無此現(xiàn)象;RAW-flag-E6在培養(yǎng)48h后也表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞凋亡增強(qiáng),此時(shí)細(xì)胞內(nèi)flag-ESAT-6融合蛋白濃度大約500ng/mL。
　　二、發(fā)現(xiàn)10μg/mL的rESAT-

13、6能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡,而5μg/mL的rESAT-6對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡無明顯誘導(dǎo)作用。這些數(shù)據(jù)說明ESAT-6誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡具有劑量依賴性,且細(xì)胞內(nèi)ESAT-6在較低濃度就可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡。
　　三、發(fā)現(xiàn)在連續(xù)感染RAW264.7細(xì)胞3天時(shí),rBCG-SE6感染組與BCG感染組、rBCG-E6感染組之間無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但是可以觀察到rBCG-SE6感染的巨噬細(xì)胞隨時(shí)間有細(xì)胞凋亡增強(qiáng)的趨勢(shì)。進(jìn)一步分析顯示,RAW-E6和RAW-fl

14、ag-E6的caspase-3活性均顯著升高。這些數(shù)據(jù)表明結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白ESAT-6在細(xì)胞內(nèi)低水平表達(dá)就可依賴caspase-3信號(hào)通路誘導(dǎo)小鼠RAW264.7細(xì)胞凋亡。
　　研究了EspB對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬體成熟的影響。有證據(jù)顯示,ESX-1分泌蛋白中除CFP-10和ESAT-6以外的某個(gè)蛋白對(duì)抑制吞噬體的成熟是必需的,我們推測(cè)EspB很可能就是這個(gè)關(guān)鍵分子。通過共聚焦顯微鏡觀察和E.coli的存活菌落數(shù)檢測(cè),我們分別對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)E

15、spBN的巨噬細(xì)胞系和重組BCG感染巨噬細(xì)胞的吞噬體成熟進(jìn)行了分析。
　　一、RAW-EspBN細(xì)胞系和RAW-flag-EspBN細(xì)胞系的溶酶體與吞噬體的共定位率明顯的降低;RAW-flag-EspBN細(xì)胞吞噬的E.coli存活率顯著高于野生型RAW264.7細(xì)胞和對(duì)照RAW-EGFP細(xì)胞。
　　二、rBCG-EspBN顯著地抑制了RAW-flag-E6細(xì)胞內(nèi)吞噬體成熟;但是對(duì)RAW264.7細(xì)胞則無顯著抑制吞噬體成熟作用

16、。根據(jù)上述結(jié)果,我們推測(cè)EspB的N端(即EspBN)在細(xì)胞質(zhì)中可抑制巨噬細(xì)胞吞噬體成熟,但在結(jié)核桿菌感染過程中需要ESAT-6的協(xié)助,即ESAT-6在吞噬體膜上穿孔幫助EspBN進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮作用。
　　綜上所述,本研究成功建立了穩(wěn)定表達(dá)ESAT-6和EspB的系列巨噬細(xì)胞系,構(gòu)建了過表達(dá)ESAT-6和EspB的系列重組BCG菌株,為研究?jī)蓚€(gè)蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞功能的調(diào)控作用,以及它們與巨噬細(xì)胞相互作用的分子機(jī)理提供了工具。研究發(fā)現(xiàn)E