結核分枝桿菌ESX-1分泌蛋白調控巨噬細胞功能的研究.pdf

1、近些年研究證實,ESX-1蛋白分泌系統(tǒng)與結核分枝桿菌在巨噬細胞中存活、生長繁殖及致病密切相關,是結核分枝桿菌的一個重要毒力因子?，F(xiàn)已確認,ESX-1系統(tǒng)可分泌多個結核分枝桿菌蛋白,這些分泌蛋白存在共分泌現(xiàn)象,缺失其中某種蛋白就會影響其他蛋白的分泌,同時導致結核分枝桿菌毒力及致病性的顯著下降,因此通過基因敲除和過表達去單獨研究某一種ESX-1分泌蛋白功能比較困難。目前,對于每一種ESX-1蛋白是否直接參與了結核分枝桿菌的致病過程以及參與致

2、病的分子機理是什么還不太清楚或存在不同的觀點。本文主要以兩個ESX-1分泌蛋白ESAT-6和EspB為研究對象,以建立穩(wěn)轉細胞系和重組BCG為主要手段,來考察這兩個蛋白對巨噬細胞吞噬功能、細胞凋亡和吞噬體成熟的影響,分析其調控機理,探討它們在結核分枝桿菌致病過程中的地位和所起的作用,從而加深對ESX-1分泌系統(tǒng)致病機理的了解,為研制結核病治療藥物和新型疫苗提供新的靶點。
　　首先,構建了穩(wěn)定表達ESAT-6和EspB的系列小鼠巨噬

3、細胞系。國外研究顯示,EspB在從結核分枝桿菌分泌到菌體外過程中,會被周質腔MycP1酶裂解,只有其N端(EspBN)會分泌至菌體外,可能與巨噬細胞相互作用。前期研究中,我們曾分別建立與綠色熒光蛋白EGFP融合表達的ESAT-6和EspB穩(wěn)轉細胞系RAW-E6和RAW-EspB。本研究以表達EGFP-EspB融合蛋白的質粒為模板,通過反向PCR技術,構建了表達EGFP-EspBN融合蛋白的pEGFP-EspBN重組質粒。利用脂質體介導的

4、方法,把該重組質粒轉染至小鼠RAW264.7細胞系中,經G418篩選,及在基因水平、轉錄水平和蛋白表達水平鑒定,獲得了穩(wěn)定表達EGFP-EspBN的RAW-EspBN巨噬細胞系。考慮到EGFP是一個分子量較大的蛋白,與其融合表達會否影響ESAT-6和EspB的結構與功能還不清楚,所以我們又構建了小分子量標簽flag與ESAT-6和EspBN融合表達的巨噬細胞系。在原有表達質粒基礎上,通過反向PCR技術,構建了重組表達質粒pFLAG-ES

5、AT-6、pFLAG-EspBN和pFLAG-EGFP,經細胞轉染、篩選與鑒定,獲得了穩(wěn)定表達flag-ESAT-6、flag-EspBN和flag-EGFP融合蛋白的巨噬細胞系RAW-flag-E6、RAW-flag-EspBN和RAW-flag-EGFP。通過western blot分析了穩(wěn)轉細胞系中目標蛋白表達定位情況,發(fā)現(xiàn)EGFP-EspBN和flag-EspBN在細胞質和細胞膜上均有分布,flag-ESAT-6與flag-EG

6、FP主要表達于RAW264.7細胞質中。這一系列細胞系的建立為研究ESAT-6和EspB對巨噬細胞功能的調控作用,以及它們與巨噬細胞相互作用的分子機理提供了研究工具。
　　其次,構建了表達ESAT-6和EspB的系列重組BCG。BCG是減毒的牛分枝桿菌,是唯一上市的結核疫苗,其基因組中沒有RD-1區(qū),不能表達ESAT-6,雖能表達EspB但不能分泌。因此,為排除ESX-1共分泌系統(tǒng)其他蛋白的干擾,我們研究ESAT-6與EspB生物

7、功能的另外一個策略就是構建分泌表達ESAT-6和EspBN的重組BCG(rBCG)。將ESAT-6基因與sESAT-6基因(帶Ag85B信號肽序列)分別克隆進穿梭質粒pLYG206中,構建了表達質粒pLYG-ESAT-6和pLYG-SESAT-6。通過電轉化的方法,把這兩個表達載體分別轉入BCG,經zeocin抗生素篩選,菌落PCR鑒定與western blot分析,分別獲得胞內表達ESAT-6的rBCG-E6和分泌表達ESAT-6的r

8、BCG-SE6。將EspB與EspBN基因克隆進pLYG206,構建了表達質粒pLYG-EspB和pLYG-EspBN。通過轉化、篩選與鑒定,分別獲得表達EspB的rBCG-EB和表達EspBN的rBCG-EN。進一步分析發(fā)現(xiàn),rBCG-EN能夠以一種未知的方式分泌表達EspBN至菌體外,而rBCG-EB只能夠在細胞內表達EspB。系列重組BCG的獲得為建立結核分枝桿菌的感染模型,探討ESX-1分泌蛋白對巨噬細胞的調控作用,以及構建新型

9、疫苗提供了基礎。
　　研究了ESAT-6對巨噬細胞吞噬功能的影響。吞噬功能是巨噬細胞對抗病原入侵的早期防御性反應,而ESAT-6作為結核分枝桿菌早期分泌的毒力蛋白已被證實通過多種途徑調控巨噬細胞功能。因此我們推測ESAT-6可能也會影響巨噬細胞的吞噬功能,并分別以穩(wěn)轉巨噬細胞系、重組蛋白處理巨噬細胞和重組BCG感染巨噬細胞三種方式考察了ESAT-6對巨噬細胞吞噬功能的影響。
　　一、通過流式細胞儀、共聚焦顯微鏡和菌落計數(shù)等方

10、法分析顯示,穩(wěn)轉細胞系RAW-E6(表達EGFP-ESAT-6融合蛋白)和RAW-flag-E6(表達flag-ESAT-6融合蛋白)吞噬熒光微球及E.coli的能力明顯增強。
　　二、經流式細胞儀分析,重組ESAT-6蛋白處理的RAW264.7細胞顯示出吞噬熒光微球的能力增強。
　　三、類似方法分析顯示,rBCG-SE6感染RAW264.7細胞可增強巨噬細胞的吞噬功能,而rBCG-E6對吞噬功能無顯著影響。這些結果均說明了

11、ESAT-6能夠增強小鼠巨噬細胞的吞噬功能。進一步,我們對可能增強巨噬細胞吞噬功能的因素p38、IL-12和ESAT-6膜穿孔作用進行了考察,結果顯示ESAT-6增強巨噬細胞吞噬功能不依賴于p38途徑和細胞因子IL-12,而是可能與ESAT-6的膜穿孔作用有關。
　　研究了ESAT-6對巨噬細胞凋亡的影響。許多研究報道,結核分枝桿菌能夠誘導巨噬細胞以及上皮細胞的凋亡,但其誘導巨噬細胞凋亡的成分和對誘導凋亡機理的解釋各不相同。為了解

12、ESAT-6在這一過程中的作用及探討可能的分子機理,本研究通過流式細胞術分別考察了穩(wěn)轉巨噬細胞系、重組蛋白處理的巨噬細胞和重組BCG感染的巨噬細胞的凋亡情況。
　　一、發(fā)現(xiàn)RAW-E6只有在培養(yǎng)48h后才能夠表現(xiàn)出顯著的細胞凋亡增強,培養(yǎng)24h時無此現(xiàn)象;RAW-flag-E6在培養(yǎng)48h后也表現(xiàn)出顯著的細胞凋亡增強,此時細胞內flag-ESAT-6融合蛋白濃度大約500ng/mL。
　　二、發(fā)現(xiàn)10μg/mL的rESAT-

13、6能夠誘導巨噬細胞凋亡,而5μg/mL的rESAT-6對巨噬細胞凋亡無明顯誘導作用。這些數(shù)據(jù)說明ESAT-6誘導細胞凋亡具有劑量依賴性,且細胞內ESAT-6在較低濃度就可誘導巨噬細胞凋亡。
　　三、發(fā)現(xiàn)在連續(xù)感染RAW264.7細胞3天時,rBCG-SE6感染組與BCG感染組、rBCG-E6感染組之間無顯著統(tǒng)計學差異,但是可以觀察到rBCG-SE6感染的巨噬細胞隨時間有細胞凋亡增強的趨勢。進一步分析顯示,RAW-E6和RAW-fl

14、ag-E6的caspase-3活性均顯著升高。這些數(shù)據(jù)表明結核分枝桿菌分泌蛋白ESAT-6在細胞內低水平表達就可依賴caspase-3信號通路誘導小鼠RAW264.7細胞凋亡。
　　研究了EspB對巨噬細胞吞噬體成熟的影響。有證據(jù)顯示,ESX-1分泌蛋白中除CFP-10和ESAT-6以外的某個蛋白對抑制吞噬體的成熟是必需的,我們推測EspB很可能就是這個關鍵分子。通過共聚焦顯微鏡觀察和E.coli的存活菌落數(shù)檢測,我們分別對穩(wěn)轉E

15、spBN的巨噬細胞系和重組BCG感染巨噬細胞的吞噬體成熟進行了分析。
　　一、RAW-EspBN細胞系和RAW-flag-EspBN細胞系的溶酶體與吞噬體的共定位率明顯的降低;RAW-flag-EspBN細胞吞噬的E.coli存活率顯著高于野生型RAW264.7細胞和對照RAW-EGFP細胞。
　　二、rBCG-EspBN顯著地抑制了RAW-flag-E6細胞內吞噬體成熟;但是對RAW264.7細胞則無顯著抑制吞噬體成熟作用

16、。根據(jù)上述結果,我們推測EspB的N端(即EspBN)在細胞質中可抑制巨噬細胞吞噬體成熟,但在結核桿菌感染過程中需要ESAT-6的協(xié)助,即ESAT-6在吞噬體膜上穿孔幫助EspBN進入細胞質發(fā)揮作用。
　　綜上所述,本研究成功建立了穩(wěn)定表達ESAT-6和EspB的系列巨噬細胞系,構建了過表達ESAT-6和EspB的系列重組BCG菌株,為研究兩個蛋白對巨噬細胞功能的調控作用,以及它們與巨噬細胞相互作用的分子機理提供了工具。研究發(fā)現(xiàn)E