結(jié)核分枝桿菌分泌性效應(yīng)分子的鑒定、功能與信號(hào)傳遞研究.pdf

1、由結(jié)核分枝桿菌感染導(dǎo)致的結(jié)核病仍然是世界上最致命的傳染性疾病之一。全球約有三分之一的人口潛伏感染結(jié)核病。在2013年，全球大約有900萬(wàn)人患結(jié)核病，其中中國(guó)患者約占總比例數(shù)的11％;另外還有150萬(wàn)結(jié)核病患者死亡，其中36萬(wàn)人為結(jié)核病和艾滋病毒共感染患者。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在2013年，全球約有48萬(wàn)人患耐多藥結(jié)核病，其中約有9.0％的耐多藥結(jié)核病患者罹患廣泛耐藥結(jié)核病。這些觸目驚心的數(shù)字表明結(jié)核分枝桿菌是人類(lèi)最難對(duì)付的致病菌之一。結(jié)核分枝桿菌之

2、所以有如此大的破壞力，是因?yàn)槠湓谒拗骶奘杉?xì)胞內(nèi)成功的生存策略，而這主要?dú)w功于該菌釋放的效應(yīng)分子（或毒力因子）。結(jié)核分枝桿菌的效應(yīng)分子包含各類(lèi)脂質(zhì)和分泌蛋白。目前鑒定出來(lái)的效應(yīng)分子主要分為三類(lèi):(1)能增強(qiáng)結(jié)核分枝桿菌抵抗宿主產(chǎn)生的殺菌復(fù)合物，如KatG、SodC和AhpC;(2)能阻斷吞噬體成熟過(guò)程，如PtpA、PknG和SapM;(3)能抑制宿主細(xì)胞的凋亡，如NuoG和SodA。但這些效應(yīng)分子還無(wú)法完全解析結(jié)核分枝桿菌的致病性;因此，

3、鑒定和研究新的效應(yīng)分子仍是當(dāng)前工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)?；谝陨犀F(xiàn)狀，本論文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究。
　　首先，本文介紹了一種綜合性的新型生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)參與宿主-病原菌相互作用的結(jié)核分枝桿菌關(guān)鍵性分泌蛋白。我們利用聚類(lèi)分析方法按以下標(biāo)準(zhǔn)盡可能多地收集已有的文獻(xiàn)數(shù)據(jù):(a)攻擊巨噬細(xì)胞后結(jié)核分枝桿菌的基因表達(dá)和DNA芯片數(shù)據(jù);(b)利用全基因組插入誘變技術(shù)鑒定不同條件下基因的必需性數(shù)據(jù);(c)攻擊動(dòng)物模型后結(jié)核分枝桿菌基因表達(dá)數(shù)據(jù);

4、(d)結(jié)核病患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌基因表達(dá)數(shù)據(jù);(e)結(jié)核分枝桿菌臨床菌株丟失的基因數(shù)據(jù);(f)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位數(shù)據(jù);(g)結(jié)核分枝桿菌與宿主及宿主腸道菌群蛋白質(zhì)組的非同源性分析數(shù)據(jù)。然后按照不同標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行全基因組計(jì)分、排序?qū)⒉煌瑪?shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)整合起來(lái)。接著我們預(yù)測(cè)到結(jié)核分枝桿菌中54個(gè)潛在的與宿主相互作用的關(guān)鍵性分泌蛋白。這些蛋白質(zhì)符合以下特征:在結(jié)核分枝桿菌感染過(guò)程中上調(diào)表達(dá)，結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi)存活而非胞外存活所必須，在臨床菌株中保守存在，

5、定位于細(xì)菌胞外，與宿主及宿主腸道菌群蛋白質(zhì)組沒(méi)有同源物。最后我們探討了這些分泌蛋白進(jìn)一步深入研究的可能性和重要性，為抗結(jié)核藥物的開(kāi)發(fā)提供了可供選擇的平臺(tái)。
　　接著，我們選擇一個(gè)可能的分泌蛋白R(shí)v3402c進(jìn)行了深入細(xì)致的分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)方面的研究，本文重點(diǎn)研究了Rv3402c與宿主巨噬細(xì)胞之間的相互作用。首先我們構(gòu)建了能夠表達(dá)Rv3402c蛋白的重組恥垢分枝桿菌(簡(jiǎn)寫(xiě)為MS_Rv3402c)和空載體重組恥垢分枝桿菌(簡(jiǎn)寫(xiě)為

6、MS_Vec)。利用蛋白酶敏感性分析實(shí)驗(yàn)和Western blot首次實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Rv3402c蛋白是一個(gè)分泌蛋白。接著發(fā)現(xiàn)重組菌MS_Rv3402c在巨噬細(xì)胞中的存活率顯著增加，且該重組菌能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的裂解死亡。重組菌MS_Rv3402c和對(duì)照菌MS_Vec在無(wú)菌培養(yǎng)基中顯示出相同的生長(zhǎng)速率，而且各自的抗壓能力也不相上下，這暗示MS_Rv3402c胞內(nèi)存活能力的增強(qiáng)可能是Rv3402c蛋白干擾宿主細(xì)胞先天免疫應(yīng)答的結(jié)果。ELISA以及

7、半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MS_Rv3402c刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎性因子TNF-α和IL-1β的能力明顯高于MS_Vec。我們利用純化的Rv3402c蛋白也佐證了這些細(xì)胞因子是特異性地由該蛋白介導(dǎo)產(chǎn)生的。通過(guò)信號(hào)通路抑制劑實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)NF-κB，ERK1/2和p38信號(hào)途徑對(duì)于Rv3402c誘導(dǎo)的TNF-α分泌是必需的。不過(guò)只有NF-κB和ERK1/2信號(hào)通路是Rv3402c誘導(dǎo)的IL-1β分泌所需的，而p38途徑對(duì)其分泌沒(méi)有影

8、響。這說(shuō)明Rv3402c刺激這兩種細(xì)胞因子分泌的信號(hào)途徑可能存在差異。以上結(jié)果揭示Rv3402c可能通過(guò)干擾宿主的信號(hào)途徑來(lái)擾亂宿主的免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致細(xì)菌的胞內(nèi)存活率提高以及巨噬細(xì)胞的加速裂解死亡。
　　最后，本文研究了結(jié)核分枝桿菌中著名的分泌性效應(yīng)分子PtpA（蛋白酪氨酸磷酸酶A）的調(diào)控蛋白PtkA（蛋白酪氨酸激酶A）的一些重要功能。序列比對(duì)結(jié)果顯示，PtkA最開(kāi)始被認(rèn)為是鹵酸脫鹵酶超家族的一員。不過(guò)通過(guò)生物化學(xué)方法分析其酶活

9、性后發(fā)現(xiàn)該蛋白是一個(gè)蛋白酪氨酸激酶，且能磷酸化PtpA并調(diào)控其磷酸酶酶活性。我們首先聯(lián)合體外蛋白激酶實(shí)驗(yàn)和放射性雙向電泳技術(shù)鑒定PtkA的底物，意外地發(fā)現(xiàn)了PtkA的上游調(diào)控蛋白，該蛋白能夠抑制PtkA的激酶活性。雖然目前還不能確定是哪個(gè)蛋白發(fā)揮抑制作用，但我們推測(cè)這極有可能是至今仍未見(jiàn)報(bào)道PtkA其它底物的主要原因。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的重組PtkA蛋白及體外蛋白激酶實(shí)驗(yàn)條件，然后利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)到8個(gè)潛在的酪氨酸磷

10、酸化蛋白質(zhì)。通過(guò)一系列生物化學(xué)方法體外證明了TrxB2是PtkA在結(jié)核分枝桿菌中除自身及PtpA以外的第三個(gè)蛋白酪氨酸激酶底物，其磷酸化殘基為32位的酪氨酸。根據(jù)序列比對(duì)信息發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌的TrxB2和惡臭假單胞菌（P.putida）中的同源蛋白TrxB2的磷酸化酪氨酸殘基是相同位置，且磷酸化酪氨酸殘基附近的氨基酸同源性也相當(dāng)高。該結(jié)果從而也驗(yàn)證了細(xì)菌之間磷酸化位點(diǎn)的保守性。通過(guò)酶活分析以及western blot等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PtkA

11、對(duì)TrxB2的磷酸化作用不影響后者的酶活性，但能抑制TrxB2的分泌;也就是說(shuō)結(jié)核分枝桿菌H37RvΔptkA突變株分泌了更多的TrxB2到細(xì)菌細(xì)胞外。本實(shí)驗(yàn)室未發(fā)表的反向遺傳學(xué)數(shù)據(jù)顯示，體外培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌H37RvΔptkA突變株比野生株更加耐受H2O2和氫過(guò)氧化枯烯。鑒于TrxB2是一個(gè)硫氧還蛋白還原酶，文獻(xiàn)報(bào)道它能中和氧化壓力。因此，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以解釋這一現(xiàn)象:結(jié)核分枝桿菌H37RvΔptkA突變株分泌了更多的TrxB2到