結(jié)核分枝桿菌分泌性效應(yīng)分子的鑒定、功能與信號傳遞研究.pdf

1、由結(jié)核分枝桿菌感染導(dǎo)致的結(jié)核病仍然是世界上最致命的傳染性疾病之一。全球約有三分之一的人口潛伏感染結(jié)核病。在2013年，全球大約有900萬人患結(jié)核病，其中中國患者約占總比例數(shù)的11％;另外還有150萬結(jié)核病患者死亡，其中36萬人為結(jié)核病和艾滋病毒共感染患者。據(jù)統(tǒng)計，在2013年，全球約有48萬人患耐多藥結(jié)核病，其中約有9.0％的耐多藥結(jié)核病患者罹患廣泛耐藥結(jié)核病。這些觸目驚心的數(shù)字表明結(jié)核分枝桿菌是人類最難對付的致病菌之一。結(jié)核分枝桿菌之

2、所以有如此大的破壞力，是因為其在宿主巨噬細胞內(nèi)成功的生存策略，而這主要歸功于該菌釋放的效應(yīng)分子（或毒力因子）。結(jié)核分枝桿菌的效應(yīng)分子包含各類脂質(zhì)和分泌蛋白。目前鑒定出來的效應(yīng)分子主要分為三類:(1)能增強結(jié)核分枝桿菌抵抗宿主產(chǎn)生的殺菌復(fù)合物，如KatG、SodC和AhpC;(2)能阻斷吞噬體成熟過程，如PtpA、PknG和SapM;(3)能抑制宿主細胞的凋亡，如NuoG和SodA。但這些效應(yīng)分子還無法完全解析結(jié)核分枝桿菌的致病性;因此，

3、鑒定和研究新的效應(yīng)分子仍是當(dāng)前工作的重點和難點?；谝陨犀F(xiàn)狀，本論文主要從以下幾個方面進行研究。
　　首先，本文介紹了一種綜合性的新型生物信息學(xué)方法預(yù)測參與宿主-病原菌相互作用的結(jié)核分枝桿菌關(guān)鍵性分泌蛋白。我們利用聚類分析方法按以下標(biāo)準(zhǔn)盡可能多地收集已有的文獻數(shù)據(jù):(a)攻擊巨噬細胞后結(jié)核分枝桿菌的基因表達和DNA芯片數(shù)據(jù);(b)利用全基因組插入誘變技術(shù)鑒定不同條件下基因的必需性數(shù)據(jù);(c)攻擊動物模型后結(jié)核分枝桿菌基因表達數(shù)據(jù);

4、(d)結(jié)核病患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌基因表達數(shù)據(jù);(e)結(jié)核分枝桿菌臨床菌株丟失的基因數(shù)據(jù);(f)蛋白質(zhì)亞細胞定位數(shù)據(jù);(g)結(jié)核分枝桿菌與宿主及宿主腸道菌群蛋白質(zhì)組的非同源性分析數(shù)據(jù)。然后按照不同標(biāo)準(zhǔn)進行全基因組計分、排序?qū)⒉煌瑪?shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)整合起來。接著我們預(yù)測到結(jié)核分枝桿菌中54個潛在的與宿主相互作用的關(guān)鍵性分泌蛋白。這些蛋白質(zhì)符合以下特征:在結(jié)核分枝桿菌感染過程中上調(diào)表達，結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi)存活而非胞外存活所必須，在臨床菌株中保守存在，

5、定位于細菌胞外，與宿主及宿主腸道菌群蛋白質(zhì)組沒有同源物。最后我們探討了這些分泌蛋白進一步深入研究的可能性和重要性，為抗結(jié)核藥物的開發(fā)提供了可供選擇的平臺。
　　接著，我們選擇一個可能的分泌蛋白Rv3402c進行了深入細致的分子生物學(xué)與細胞生物學(xué)方面的研究，本文重點研究了Rv3402c與宿主巨噬細胞之間的相互作用。首先我們構(gòu)建了能夠表達Rv3402c蛋白的重組恥垢分枝桿菌(簡寫為MS_Rv3402c)和空載體重組恥垢分枝桿菌(簡寫為

6、MS_Vec)。利用蛋白酶敏感性分析實驗和Western blot首次實驗證實了Rv3402c蛋白是一個分泌蛋白。接著發(fā)現(xiàn)重組菌MS_Rv3402c在巨噬細胞中的存活率顯著增加，且該重組菌能誘導(dǎo)巨噬細胞的裂解死亡。重組菌MS_Rv3402c和對照菌MS_Vec在無菌培養(yǎng)基中顯示出相同的生長速率，而且各自的抗壓能力也不相上下，這暗示MS_Rv3402c胞內(nèi)存活能力的增強可能是Rv3402c蛋白干擾宿主細胞先天免疫應(yīng)答的結(jié)果。ELISA以及

7、半定量RT-PCR實驗結(jié)果顯示，MS_Rv3402c刺激巨噬細胞產(chǎn)生促炎性因子TNF-α和IL-1β的能力明顯高于MS_Vec。我們利用純化的Rv3402c蛋白也佐證了這些細胞因子是特異性地由該蛋白介導(dǎo)產(chǎn)生的。通過信號通路抑制劑實驗，我們發(fā)現(xiàn)NF-κB，ERK1/2和p38信號途徑對于Rv3402c誘導(dǎo)的TNF-α分泌是必需的。不過只有NF-κB和ERK1/2信號通路是Rv3402c誘導(dǎo)的IL-1β分泌所需的，而p38途徑對其分泌沒有影

8、響。這說明Rv3402c刺激這兩種細胞因子分泌的信號途徑可能存在差異。以上結(jié)果揭示Rv3402c可能通過干擾宿主的信號途徑來擾亂宿主的免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致細菌的胞內(nèi)存活率提高以及巨噬細胞的加速裂解死亡。
　　最后，本文研究了結(jié)核分枝桿菌中著名的分泌性效應(yīng)分子PtpA（蛋白酪氨酸磷酸酶A）的調(diào)控蛋白PtkA（蛋白酪氨酸激酶A）的一些重要功能。序列比對結(jié)果顯示，PtkA最開始被認為是鹵酸脫鹵酶超家族的一員。不過通過生物化學(xué)方法分析其酶活

9、性后發(fā)現(xiàn)該蛋白是一個蛋白酪氨酸激酶，且能磷酸化PtpA并調(diào)控其磷酸酶酶活性。我們首先聯(lián)合體外蛋白激酶實驗和放射性雙向電泳技術(shù)鑒定PtkA的底物，意外地發(fā)現(xiàn)了PtkA的上游調(diào)控蛋白，該蛋白能夠抑制PtkA的激酶活性。雖然目前還不能確定是哪個蛋白發(fā)揮抑制作用，但我們推測這極有可能是至今仍未見報道PtkA其它底物的主要原因。實驗過程中，我們優(yōu)化了實驗室現(xiàn)有的重組PtkA蛋白及體外蛋白激酶實驗條件，然后利用生物信息學(xué)方法預(yù)測到8個潛在的酪氨酸磷

10、酸化蛋白質(zhì)。通過一系列生物化學(xué)方法體外證明了TrxB2是PtkA在結(jié)核分枝桿菌中除自身及PtpA以外的第三個蛋白酪氨酸激酶底物，其磷酸化殘基為32位的酪氨酸。根據(jù)序列比對信息發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌的TrxB2和惡臭假單胞菌（P.putida）中的同源蛋白TrxB2的磷酸化酪氨酸殘基是相同位置，且磷酸化酪氨酸殘基附近的氨基酸同源性也相當(dāng)高。該結(jié)果從而也驗證了細菌之間磷酸化位點的保守性。通過酶活分析以及western blot等試驗發(fā)現(xiàn)PtkA

11、對TrxB2的磷酸化作用不影響后者的酶活性，但能抑制TrxB2的分泌;也就是說結(jié)核分枝桿菌H37RvΔptkA突變株分泌了更多的TrxB2到細菌細胞外。本實驗室未發(fā)表的反向遺傳學(xué)數(shù)據(jù)顯示，體外培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌H37RvΔptkA突變株比野生株更加耐受H2O2和氫過氧化枯烯。鑒于TrxB2是一個硫氧還蛋白還原酶，文獻報道它能中和氧化壓力。因此，我們的實驗結(jié)果可以解釋這一現(xiàn)象:結(jié)核分枝桿菌H37RvΔptkA突變株分泌了更多的TrxB2到