結核分枝桿菌磷酸酶ptpB抑制巨噬細胞殺傷TB的功能研究.pdf

1、目的：結核病是由結核分枝桿菌（Mtb）感染引起的嚴重的慢性傳染性疾病，世界上有三分之一的人口感染結核分枝桿菌，每年造成約兩百萬人死亡。近年來，隨著結核分枝桿菌的多重耐藥性菌株的出現(xiàn)及與艾滋病的共感染，結核病的控制難度不斷加大。為研發(fā)新型的疫苗及治療藥物，我們需要對結核病發(fā)病的分子機制做透徹的研究。MptpB是Mtb分泌的重要毒力因子。從結構上看MptpB屬于酪氨酸磷酸酶，體外實驗顯示出對酪氨酸，絲氨酸/蘇氨酸及磷酸肌醇的磷酸酶活性，體內

2、底物尚不清楚。MptpB缺失的Mtb感染豚鼠后細菌載量比野生型低越70倍，感染活化的巨噬細胞后細菌載量也比野生型低5到7倍，說明MptpB抑制了巨噬細胞殺傷Mtb的功能，是支持Mtb在體內存活的重要毒力因子。本研究的目的是探查MptpB在巨噬細胞中的作用，并初步探討其作用機制。
　　方法：⑴克隆了MptpB基因，構建了其真核載體，并建立了過表達MptpB的巨噬細胞系Raw-MptpB。為檢測過表達的MptpB對Mtb存活的影響，我

3、們用H37Rv感染了Raw-MptpB及對照細胞，并分別計數(shù)了細菌載量。結果表明，Raw-MptpB細胞在感染H37Rv2-6天后細菌載量比對照細胞高2-4倍。⑵為確定MptpB對巨噬細胞免疫功能的影響，我們在用IFN-γ，LPS及H37Rv刺激Raw-MptpB及對照細胞后，用real time PCR及ELISA檢測了多種細胞因子的表達，發(fā)現(xiàn)MptpB抑制了IL-1β及IL-6在巨噬細胞中的表達；我們同時用western blot測

4、定iNOS表達量，并檢測了其產物NO的含量，發(fā)現(xiàn)MptpB抑制了iNOS的表達并降低了 NO在培養(yǎng)液中的濃度；我們用被剪切的 caspase3的蛋白量,caspase3的活性及p53蛋白水平來檢測Raw-MptpB細胞的凋亡，發(fā)現(xiàn)MptpB抑制了IFN-γ及H37Rv誘導的細胞凋亡。⑶為探討MptpB抑制巨噬細胞功能的機制，我們在用IFN-γ，LPS及H37Rv刺激Raw-MptpB及對照細胞后，檢測了STAT1，p65，Erk1/2，

5、p38，JNK等信號分子的磷酸化及蛋白量。
　　結果：MptpB能夠抑制p65和p38的磷酸化，從而抑制NF- B信號途徑。在細菌中表達了帶His標簽的MptpB蛋白，與巨噬細胞裂解液共孵育后，用His Beads進行免疫共沉淀。沉淀產物用SDS-PAGE膠分離，質譜鑒定。根據(jù)質譜鑒定結果，我們克隆了可能的MptpB互作蛋白，構建其真核表達載體，與MptpB真核表達載體共轉染了293T細胞，進行免疫共沉淀的驗證。驗證結果表明，Rv

6、b1/Rvb2是MptpB在巨噬細胞內的相互作用蛋白。
　　結論：在巨噬細胞中過表達MptpB能夠促進H37Rv在巨噬細胞中的存活。MptpB抑制了iNOS的表達以減少NOS產物，抑制了巨噬細胞的凋亡，并抑制了促炎因子IL-1β及IL-6的表達，從而阻礙了巨噬細胞對Mtb的殺滅。MptpB通過抑制p65、p38及Erk1/2的磷酸化阻礙了NF-κB和MAPK信號通路，抑制了iNOS及炎性因子的表達。其機制可能與其相互作用蛋白Rvb