巨噬細胞酸性磷酸酶的顯示

1、細胞生物學(xué)實驗1巨噬細胞酸性磷酸酶的顯示巨噬細胞酸性磷酸酶的顯示一、一、實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康囊孕∈蟾骨痪奘杉毎麨椴牧?，通過顯示其溶酶體代表酶—酸性磷酸酶，學(xué)習(xí)酶細胞化學(xué)的一般原理及方法。二、二、實驗原理實驗原理酸性磷酸酶能分解磷酸脂（常用β甘油磷酸鈉）而釋放出磷酸基。在pH5.0的環(huán)境中，磷酸基能與鉛鹽（硝酸鉛，捕捉劑）反應(yīng)形成無色的磷酸鉛（微細沉淀，可在電鏡下觀察），再經(jīng)過與硫化銨作用，形成棕黑色的硫化鉛沉淀（可在光鏡下觀察），以此顯示酸

2、性磷酸酶在細胞內(nèi)的存在與分布。三、三、實驗儀器及試劑實驗儀器及試劑a)小白鼠：實驗前2天，一部分腹腔注射4%淀粉肉湯1mL誘導(dǎo)及活化巨噬細胞，另一部分不作處理。b)試劑：4％淀粉肉湯，10％中性福爾馬林（pH6.8~7.1），酸性磷酸酶作用液（現(xiàn)配），1％硫化銨溶液。c)水浴箱（50℃，37℃）、低溫冰箱、普通光學(xué)顯微鏡，小剪刀、5mL一次性注射器、10mL玻璃離心管、試管架、塑料滴管、載玻片染色盒（缸）、自制濕盒、塑料培養(yǎng)皿、蓋玻片、

3、載玻片。四、四、實驗步驟實驗步驟a)巨噬細胞收集：分別用脫頸法處死一只腹腔注射4％淀粉肉湯1mL的小鼠和一只不注射的小鼠。然后都在腹腔注入2mL生理鹽水，揉勻；剪開腹部皮膚，暴露腹膜；用帶針頭的注射器插進腹腔吸取腹腔液。b)細胞黏附：對于注射了淀粉肉末的小鼠腹腔液一組共做6片，每片2~3滴，其中放入4℃冰箱黏附30min的每人一片；而放入濕盒內(nèi)，50℃水浴30min，滅活酸性磷酸酶的則2人一片。對于未注射淀粉肉末的小鼠腹腔液則只做置于4

4、℃下的4個片子即可。c)固定：將所有載玻片置于放有預(yù)冷的10％中性福爾馬林的缸內(nèi)在4℃冰箱中固定30min。d)自來水漂洗并浸于自來水中5min。e)加酸性磷酸酶作用液反應(yīng)：再將水甩干，每個裝片加入足量的酸性磷酸酶作用液，放在37℃的水浴鍋中反應(yīng)30min。f)用自來水漂洗片刻。g)加硫化銨反應(yīng)：在通風(fēng)櫥中，加入1%硫化銨溶液后反應(yīng)10min。h)在通風(fēng)櫥中自來水沖洗。i)帶水加蓋玻片顯微觀察。陽性標本細胞質(zhì)中，出現(xiàn)許多棕色或棕黑色的顆

5、粒和斑塊。五、五、實驗結(jié)果實驗結(jié)果a)注射淀粉肉湯的在4℃下染色的圖片細胞生物學(xué)實驗3圖中細胞較大的為巨噬細胞，且因為細胞中的酸性磷酸酶未遭到破壞，所以被染上棕色。但是因為沒有注射淀粉肉湯，所以圖中的巨噬細胞相對于注射淀粉肉湯的巨噬細胞數(shù)量較少。六、六、實驗分析實驗分析a)由上述所有的實驗結(jié)果可知道注射肉湯的巨噬細胞的數(shù)量更多，而且由細胞中棕色顆粒數(shù)量及顏色可以看出注射淀粉肉湯的巨噬細胞中的酸性磷酸酶的活性更高。b)50℃的時候，細胞中

6、的磷酸酶的活性被破壞，所以無法被染上色。而在4℃磷酸酶只是暫時失活，在室溫下進行染色時，磷酸酶的活性恢復(fù)，所以能被染上色。c)但是，圖上細胞外也有很多的棕色顆粒，我不清楚是什么原因造成的。七、七、注意事項注意事項a)巨噬細胞一定要預(yù)先用淀粉肉湯激活，否則酸性磷酸酶活性差，染色淺。b)作用液應(yīng)在臨用時現(xiàn)配，儲存一段時間后會產(chǎn)生絮狀沉淀，影響反應(yīng)效果。c)孵育時間過長也可發(fā)生酶擴散。d)避免酸性磷酸酶作用液在反應(yīng)過程中干燥，否則其中的鉛離子