結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細胞lncRNA和mRNA表達譜的初步研究.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是引起結(jié)核病的致病菌。MTB能通過多種免疫逃逸機制逃避巨噬細胞(macrophage，Mψ)的清除，從而長期寄生在Mψ內(nèi)。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）廣泛參與多種生物學(xué)進程并發(fā)揮關(guān)鍵作用，且可以作為多種疾病的診斷標志物和潛在的治療靶標。但是lncRNA能否作為結(jié)核病的診斷標志物以及在MTB感染Mψ中的作用仍未清楚。

2、>　　研究目的：
　　通過基因芯片檢測MTB感染Mψ后lncRNA和mRNA表達譜的變化，篩選有望用于結(jié)核病診斷的生物標志物;初步探討了lncRNA—ENST00000360485在MTB感染Mψ中的作用，以期發(fā)現(xiàn)Mψ抵抗MTB感染的新機制。
　　研究方法：
　　分別用MTB弱毒株H37Ra和強毒株H37Rv感染入原代巨噬細胞，使用lncRNA芯片(Arraystar Human LncRNA Microarray V

3、3.0)檢測被感染巨噬細胞lncRNA和mRNA表達譜，以未感染Mψ為對照;分別挑選6條lncRNA和6條mRNA，使用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)技術(shù)驗證基因芯片結(jié)果的可重復(fù)性;使用生物信息學(xué)方法對差異表達的mRNA進行GO分析(Gene Ontology analysis，GO analysis)和KEGG通路分析(Kyoto Encyclopedia of Genes

4、and Genomes(KEGG)biological pathway analysis);使用qRT-PCR檢測32例健康志愿者和31例結(jié)核病患者的PBMC樣本，篩選有望用于結(jié)核病診斷的生物標志物;使用siRNA抑制Mψ的lncRNA-ENST00000360485表達后，感染BCG，qRT-PCR檢測其鄰近基因和Mψ細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的RNA表達水平變化，采用Western Blot檢測Mψ自噬水平的變化，通過

5、克隆形成實驗(colony-forming unit,CFU)檢測Mψ清除MTB的效果。
　　研究結(jié)果：
　　基因芯片結(jié)果顯示，H37Ra感染后，Mψ有972條lncRNA和2138條mRNA出現(xiàn)差異性表達，而H37Rv感染后，Mψ有1417條lncRNA和2478條mRNA出現(xiàn)差異性表達;所挑選的lncRNA和mRNA的表達趨勢與基因芯片結(jié)果高度一致;GO和KEGG通路分析結(jié)果分別顯示了H37Ra和H37Rv感染相關(guān)的功能

6、和代謝通路;qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)3個在健康對照和結(jié)核病人之間存在顯著性差異表達的lncRNA(ENST00000360485，MIR3945HG V1和MIR3945HG V2);ROC曲線分析結(jié)果顯示：ENST00000360485、MIR3945HG V1、MIR3945HG V2的ROC曲線下面積(AUC)為0.798、0.925、0.956，敏感性分別是83.97％、90％、89.66％，特異性分別是71.88％、81.25％

7、、90.63％;siRNA抑制ENST00000360485表達前后，ENST00000360485的上下游鄰近基因（RAP1B和MDM1）和Mψ細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的RNA表達水平?jīng)]有變化，Mψ自噬通路的活化水平和清除MTB的能力也沒有顯著性差異。
　　研究結(jié)論：
　　本研究發(fā)現(xiàn)，H37Rv和H37Ra誘導(dǎo)Mψ的lncRNA和mRNA表達譜具有顯著性差異;生物信息學(xué)分析了差異表達的mRNA所富集的功能和