脫氧核酶抗結(jié)核分枝桿菌感染的實驗研究.pdf

1、本課題設(shè)計、合成了5條靶向結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)異檸檬酸裂合酶(isocitratelyase，ICL)mRNA的特異性10-23脫氧核酶(DNAzymeordeoxyribozyme，DRz)，在無細胞體系中篩選和鑒定了上述10-23DRzs對結(jié)核分枝桿菌icimRNA的切割活性，在結(jié)核分枝桿菌內(nèi)驗證了1O-23DRz對結(jié)核分枝桿菌ICL蛋白表達及酶活性的影響，并分別研究了10-23

2、DRz對Mtb在巨噬細胞內(nèi)和小鼠體內(nèi)感染的影響，最后探討了10-23DRz與抗癆藥物異煙肼(isoniazid，INH)聯(lián)合應(yīng)用治療小鼠結(jié)核病的效果。 第一部分 結(jié)核分枝桿菌icl基因原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建、表達及rlCL的純化和多克隆抗體的制備 目的：構(gòu)建Mtbicl基因的原核表達質(zhì)粒，在E．coli中表達后純化rlCL，制備抗rICL的多克隆抗體，為后續(xù)研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。 方法：采用PCR法從Mtb基因組DNA中

3、擴增出1c1基因片段，將其插入原核表達質(zhì)粒pQE30，構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE30-ici。將pQE30-fcl轉(zhuǎn)化大腸桿菌SGl3009后用IPTG誘導(dǎo)目的基因表達，免疫印跡法(Western-blot)鑒定后采用Ni-NTA樹脂親和純化該表達產(chǎn)物，鑒定其酶活性并用此純化蛋白免疫新西蘭兔制備多克隆抗體。 結(jié)果：經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和DNA雙向測序證實，pQE30-icl原核表達載體構(gòu)建成功；pQE30-ic]在E．coli中表達的目的

4、產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析其分子量約為47kDa，免疫印跡分析證實目的蛋白可與結(jié)核病患者抗血清產(chǎn)生特異性反應(yīng)。純化的重組ICL蛋白具有異檸檬酸裂解酶的活性。雙向免疫擴散法測得該重組蛋白免疫新西蘭兔產(chǎn)生的抗體效價為l：32。 結(jié)論：成功構(gòu)建了Mtbicj基因的原核表達載體，表達和純化了具有酶活性的rlCL，并獲取了抗rICL的多克隆抗體。 第二部分 MtbiclmRNA特異性10-23DRz的設(shè)計及其在無細胞體系中切割活性

5、的鑒定 目的：設(shè)計可特異性切割MtbiclmRNA的10-23DRz，在無細胞體系中鑒定其切割icfnffiNA的活性，并探討其在不同條件下對靶mRNA的切割特點。 方法：采用計算機軟件模擬ic]mRNA的二級結(jié)構(gòu)，據(jù)此選擇適合的待切割靶點并設(shè)計針對相應(yīng)靶點的特異性10-23DRz。將icl基因亞克隆至pET32a+中的T7啟動子下游，采用T7RNA聚合酶經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄法制備Mtbicl基因的mRNA。用上述設(shè)計的10-23

6、DRzs在無細胞體系中對ICLmRNA進行切割，切割產(chǎn)物經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝胺電泳鑒定。選擇上述切割活性最強的DZ4考察不同10-23DRz劑量、不同反應(yīng)時間、不同鎂離子濃度條件下及不同錯配或突變10-23DRz的切割特點。 結(jié)果：根據(jù)高級結(jié)構(gòu)模擬圖在iclmRNA上選擇了5個切割靶點并設(shè)計了5條針對相應(yīng)靶點的10-23DRz(DZl-DZ5)。pET32-ic．1體外轉(zhuǎn)錄用載體構(gòu)建成功并經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄成功獲取了Mtbicl,基因的全

7、長mRNA。無細胞體系的切割實驗發(fā)現(xiàn)，DZl、DZ3、DZ4及DZ5可有效地切割ic2mRNA，其切割效率在30．8％～64．5％之間，以DZ4的切割效率最高。對DZ4切割活性的檢測發(fā)現(xiàn)，其對靶mRNA的切割具有劑量和時間的依賴性；當Mg2+濃度為2umol／L(相當于機體生理條件下的濃度)時即可檢測到DZ4的切割活性，在2-20umol／L范圍內(nèi)，DZ4的切割活性與Mg2+濃度呈正相關(guān)；當DZ4單側(cè)底物結(jié)合臂上出現(xiàn)一個不與靶mRNA配

8、對的堿基時其切割效率大大降低，當兩側(cè)底物結(jié)合臂上各含一個不與靶mRNA配對的堿基或其活性中心域出現(xiàn)一個堿基突變(第六位：G—C)時，DZ4完全喪失切割活性。 結(jié)論：10-23DRz可特異、有效地切割Mtb1clmRNA，且在機體生理狀態(tài)的Mg2+濃度(2umol／L)下即可發(fā)揮切割效果，有望用于抗結(jié)核分枝桿菌的感染。 第三部分 lO-23DRz對MtbICL表達及其在巨噬細胞中存活的影響 目的：探討10-23DR

9、z抑制結(jié)核分枝桿菌ICL的表達及其對Mtb在巨噬細胞內(nèi)、外存活能力的影響。 方法：利用DZ4在不同條件(DZ4單獨作用，與亞抑菌濃度的INH或EMB聯(lián)合作用，在DZ4末端修飾膽固醇分子等)下對培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中的Mtb進行處理，于處理后不同時間收集細菌，超聲破碎細菌后用乙醛酸苯腙生成法檢測上清液中ICL酶活性變化，間接酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測ICL的表達變化。分別取用或不用DZ4處理的Mtb感染巨噬細胞，于感染后不同

10、時間采用Ziehl-Heelson抗酸染色法和裂解巨噬細胞后培養(yǎng)Mtb的方法，觀察10-23DRz對Mtb感染巨噬細胞的影響。同時分別取用或不用DZ4處理的Mtb直接接種于改良羅氏培養(yǎng)基，觀察lO-23DRz對Mtb在巨噬細胞外生長的影響。 結(jié)果：5μMDZ4與亞抑菌濃度的INH聯(lián)用可顯著抑制MtbICL的表達，與單用相應(yīng)濃度的INH比較，當INH為10ug／L時，IⅫ+DZ4處理1、2、3周后MtbICL酶活性下降34．9％～

11、46．7％(P<0．01)；當INH為5ug／L時，INH+DZ4處理1、2、3周后MtbICL酶活性下降21．9％36．9％(P<0．01)。Ziehl-Heelson抗酸染色及菌落計數(shù)的結(jié)果顯示，DZ4與INH聯(lián)合處理后的Mtb在巨噬細胞THP-1內(nèi)存活的能力顯著下降，在感染后4d和7d時，THP-1細胞內(nèi)的荷菌量分別由單用相應(yīng)濃度INH處理對照組的126．5×104、307．5×104(10ug／LINH)和133．0×104、3

12、25．4×104(5μg／LINH)下降至54．6×104、114．3×104和71．7×104、174．4×104。10-23DRz對Mtb在M7H10培養(yǎng)基中的生長無明顯影響。 結(jié)論：INH可有效促進10-23DRz進入Mtb；10-23DRz與亞抑菌濃度的工Ⅻ聯(lián)用可有效抑制MtbICL的表達，降低其在巨噬細胞中的存活能力，但對Mtb在培養(yǎng)基中的生長無明顯影響。 第四部分 lO-23DRz對舭b感染小鼠的影響

13、 目的：探討ic2mRNA特異性10-23DRz對Mtb在小鼠體內(nèi)感染能力的影響。 方法：分別取用或不用iclmRNA特異性10-23DRz預(yù)處理的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株，經(jīng)小鼠尾靜脈感染BALB／C小鼠，分別于感染后的2、4、8、12w時處死各組小鼠，進行肺、脾組織的抗酸染色和菌落計數(shù)，并于感染后4w和12w時觀察各組小鼠肺、脾的病理變化。 結(jié)果：菌落計數(shù)結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌感染小鼠2周時，各組結(jié)核桿菌在小鼠體內(nèi)的

14、感染能力無顯著差別，感染4w后，INH與DZ4聯(lián)合處理后的結(jié)核分枝桿菌在小鼠體內(nèi)的感染能力顯著下降(P

15、療小鼠結(jié)核病的研究 目的：探討10-23DRz與異煙肼聯(lián)合應(yīng)用治療小鼠結(jié)核病的效果。 方法：首先用FITC標記的10-23DRz對小鼠進行滴鼻，于滴鼻后不同時間進行肺組織冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察熒光情況，探討10-23DRz滴鼻給藥的可行性。然后通過尾靜脈注射方法建立BALB／c小鼠結(jié)核病感染模型。感染小鼠進行如下分組處理：不治療對照組；單純INH治療；單純10一23DRz治療；INH+i0—23DRz聯(lián)合治療、INH

16、與對照寡脫氧核苷酸(DZ4一S)聯(lián)合治療。于初次治療6W后處死小鼠，進行肺、脾組織抗酸染色和Mtb的培養(yǎng)，觀察小鼠肺組織的病理改變。 結(jié)果：經(jīng)滴鼻途徑可有效將脫氧核酶遞送至小鼠肺部。菌落計數(shù)結(jié)果及病理檢測結(jié)果顯示，10-23DRz治療組與未治療對照組間的結(jié)果無顯著差異，INH+10—23DRz治療組、INH+DZ4一S治療組與INH治療組間結(jié)果無顯著差異。 結(jié)論：按如上實驗設(shè)計，未能觀察到10—23DRz對小鼠結(jié)核病有治