副結(jié)核分枝桿菌SOD基因?qū)?shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫研究.pdf

1、副結(jié)核病(paratuberculosis)又稱Johne's病，是由分枝桿菌屬副結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium avium ssp.paratuberculosis，MAP)引起的一種以反芻動(dòng)物為主的慢性、消耗性傳染病。目前，該病在世界廣泛流行，以奶牛業(yè)和肉牛業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家危害嚴(yán)重，現(xiàn)已成為飼養(yǎng)業(yè)嚴(yán)重流行的傳染病之一。另外，國(guó)外從人的Crohn's病患者體內(nèi)分離出MAP。因此，Johne's病已引起了全世界的廣泛關(guān)注。

2、 目前，該病尚無(wú)有效的治療藥物，因此該病的預(yù)防主要采取檢出、隔離或淘汰，即以副結(jié)核PPD進(jìn)行檢疫，對(duì)檢出的陽(yáng)性牛進(jìn)行隔離與淘汰。此外，國(guó)內(nèi)外也有采用預(yù)防接種的方法來(lái)控制該病，即將MAP熱滅活或致弱后制成疫苗，免疫接種牛和羊，可降低該病的發(fā)生率。但是疫苗接種后會(huì)使動(dòng)物血清轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，干擾變態(tài)反應(yīng)和血清學(xué)檢測(cè)，以及對(duì)結(jié)核菌素敏感，妨礙牛結(jié)核病和副結(jié)核病的變態(tài)反應(yīng)檢測(cè)。因此，有待開發(fā)新型的預(yù)防疫苗和診斷試劑，以促進(jìn)畜牧業(yè)的健康發(fā)展。 研

3、究發(fā)現(xiàn)，副結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中存在的大量分泌蛋白能有效地誘發(fā)對(duì)副結(jié)核分枝桿菌的抵抗性，產(chǎn)生免疫保護(hù)作用。其中，SOD是副結(jié)核分枝桿菌的一種主要分泌蛋白。DNA疫苗能有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生持久的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，其中，激活CTL及殺滅靶細(xì)胞是DNA疫苗發(fā)揮保護(hù)作用的最主要機(jī)制之一，而且不干擾變態(tài)反應(yīng)檢測(cè)，這正是抗副結(jié)核感染所必需的。 為了研制牛副結(jié)核病新型的預(yù)防制劑，尤其是DNA疫苗，本研究將重組質(zhì)粒pGEM-T-SOD中的S

4、OD基因亞克隆至真核表達(dá)載體pVAX1中，成功地構(gòu)建出真核表達(dá)重組質(zhì)粒pVAX1-SOD。以脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pVAX1-SOD轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中，通過熒光抗體技術(shù)和RT-PCR方法證實(shí)SOD基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獲得了表達(dá)。 以pVAX1-SOD分別對(duì)BALB/c小鼠和豚鼠進(jìn)行了免疫，同時(shí)設(shè)pVAX1、生理鹽水、副結(jié)核分枝桿菌超聲抗原對(duì)照組。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果表明，pVAX1-SOD免疫組與對(duì)照組間沒有顯著差異(P>0.05

5、)。小鼠脾臟CD3+T、CD4+T、CD8+T細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，pVAX1-SOD免疫組的CD4+T、CD8+T細(xì)胞數(shù)量與生理鹽水、pVAX1對(duì)照組間沒有差異，而CD3+T細(xì)胞數(shù)量則存在差異，但沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著水平(P>0.05)。pVAX1-SOD免疫小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清的IFN-γ含量顯著地高于生理鹽水、pVAX1對(duì)照組(P<0.05)。間接ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，免疫小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了針對(duì)SOD抗原的特異性抗體。豚鼠變態(tài)反應(yīng)結(jié)果顯