膿腫分枝桿菌對(duì)抗結(jié)核藥物的耐藥基因研究.pdf

1、研究目的：
　　擴(kuò)增分析耐抗結(jié)核藥物膿腫分枝桿菌的相關(guān)基因序列，探索膿腫分枝桿菌對(duì)抗結(jié)核藥物的耐藥機(jī)制，為進(jìn)一步系統(tǒng)探索膿腫分枝桿菌的多種耐藥機(jī)制打下基礎(chǔ)，為臨床開發(fā)治療分支桿菌感染的新途徑提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.從院內(nèi)感染標(biāo)本中分離膿腫分枝桿菌，液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法測(cè)定抗結(jié)核藥物(鏈霉素、異煙肼、乙胺丁醇)對(duì)膿腫分枝桿菌臨床株和標(biāo)準(zhǔn)株的最小抑菌濃度(MIC)，分析膿腫分枝桿菌臨床株和標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)這幾種抗結(jié)核藥

2、物的耐藥情況。
　　2.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增rpsl、inhA、katG、embB基因。擴(kuò)增產(chǎn)物DNA測(cè)序，所測(cè)序列與膿腫分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株、結(jié)核分枝桿菌敏感株(H37RV)的相關(guān)基因序列進(jìn)行比較，尋找膿腫分枝桿菌對(duì)鏈霉素、異煙肼、乙胺丁醇的耐藥基因，并進(jìn)一步分析基因差異的性質(zhì)，探索其耐藥機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.從臨床感染標(biāo)本中分離出的6株膿腫分枝桿菌，其中4株分離自皮膚感染患者，2株分離自肺部感染患者。6株臨床

3、株對(duì)鏈霉素、異煙肼、乙胺丁醇都呈現(xiàn)高度耐藥，且MIC無差異。膿腫分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC19977)對(duì)三種抗結(jié)核藥物的MIC和臨床株無差異，仍表現(xiàn)高度耐藥。證明了膿腫分支桿菌對(duì)抗結(jié)核藥物是天然耐藥的。
　　2.PCR擴(kuò)增出了6株臨床菌和標(biāo)準(zhǔn)菌株的embB、KatG、inhA、rpsl基因。embB3216bp、KatG2200 bp、rpsl375 bp、inhA810 bp，與Genebank中的相應(yīng)基因一致。
　　3.P

4、CR擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA序列比對(duì)分析結(jié)果：膿腫分支桿菌的6株臨床菌和標(biāo)準(zhǔn)株的embB、KatG、rpsl、inhA基因一致性分別為99.7％、98.6％、100％、99％，僅在少數(shù)位點(diǎn)上呈現(xiàn)核苷酸的差異表達(dá)，具體差異點(diǎn)見附圖。結(jié)合藥敏試驗(yàn)，提示這些差異表達(dá)的位點(diǎn)不是其耐藥基因，與耐藥性無關(guān)。同時(shí)，不同的臨床株和標(biāo)準(zhǔn)株之間同一基因DNA序列的高度一致性，也說明膿腫分支桿菌在基因上的保守性和穩(wěn)定性。
　　4.7株膿腫分支桿菌的embB、K

5、atG、rpsl、inhA基因所測(cè)序列與結(jié)核分支桿菌敏感株(H37RV)的比對(duì)結(jié)果：7株膿腫分支桿菌的embB、KatG、rpsl、inhA基因與H37RV的相應(yīng)基因在大小上基本一致。DNA序列比對(duì)分析顯示：膿腫分支桿菌與H37RV的embB基因DNA序列差異表達(dá)位點(diǎn)900多個(gè)，但在306位密碼子的位點(diǎn)上沒有差異，為ATG。KatG基因DNA序列差異表達(dá)位點(diǎn)603個(gè)，在305位密碼子上位點(diǎn)上存在核苷酸差異表達(dá)，但編碼的氨基酸一致，是無義

6、的。InhA基因DNA序列差異表達(dá)位點(diǎn)146個(gè)。rpsl基因DNA序列的相似性為100％，無差異
　　結(jié)論：
　　膿腫分支桿菌耐乙胺丁醇不是由于embB上306位密碼子的編碼基因所致，這和結(jié)核分支桿菌獲得性耐乙胺丁醇是不同的，說明膿腫分支桿菌對(duì)乙胺丁醇的天然耐藥基因可能存在于我們發(fā)現(xiàn)的這些差異點(diǎn)中。膿腫分支桿菌耐鏈霉素與rpsl無關(guān)，這和國內(nèi)外研究的其他分支桿菌耐鏈霉素如結(jié)核分支桿菌、恥垢分支桿菌明顯差異。說明膿腫分支桿菌耐