結(jié)核分枝桿菌表觀(guān)遺傳與耐藥新機(jī)理研究.pdf

1、結(jié)核病，一種古老的疾病，仍然是威脅人類(lèi)健康的重要傳染性疾病之一，其致病菌是結(jié)核分枝桿菌。全世界大約有三分之一的人潛伏性患有結(jié)核病。據(jù)2016全球結(jié)核病報(bào)告統(tǒng)計(jì)，2015年，全世界新發(fā)結(jié)核病數(shù)量約為1040萬(wàn)例，其中中國(guó)患者約占總比例人數(shù)的7.7%，另外每年大約有140萬(wàn)結(jié)核病患者死亡。結(jié)核病難以治愈的主要原因是由于其具有三大“武器”：毒力、持留性和抗生素耐受。蛋白質(zhì)賴(lài)氨酸乙酰化是一種在真核生物和原核生物中是廣泛存在的，由賴(lài)氨酸乙?；负?/p>

2、去乙?；杆呋目赡娴姆g后修飾，它在生物體的多種生理途徑如轉(zhuǎn)錄、翻譯、代謝、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、細(xì)胞分裂或細(xì)胞死亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等扮演著重要角色。賴(lài)氨酸戊二?；亲罱鼊偘l(fā)現(xiàn)的一種新型的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，其在調(diào)控代謝途徑中發(fā)揮著重要作用。sRNAs（small RNA）是一種長(zhǎng)度為50-500nt左右的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其主要分為兩種類(lèi)型：順式編碼sRNA和反式編碼sRNA，它們均可通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄、翻譯、mRNA穩(wěn)定性等來(lái)發(fā)揮調(diào)控作用。sRNAs已經(jīng)被證

3、明在細(xì)菌各種生理途徑如糖或氮代謝、鐵平衡、抗生素耐受中扮演著重要角色。因此，賴(lài)氨酸乙酰化修飾、戊二?；蛃RNAs極有可能在結(jié)核分枝桿菌的毒力和抗生素耐受中發(fā)揮一定作用。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、爬妹庖哂H和富集和高靈敏度的質(zhì)譜聯(lián)用方法，對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv的乙?；鞍踪|(zhì)和乙酰化為點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)，總共鑒定到658個(gè)乙酰化蛋白質(zhì)和1128個(gè)乙?；稽c(diǎn)，并利用GO富集分析等生物信息學(xué)方法對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行了初步分析，發(fā)現(xiàn)賴(lài)氨酸乙酰化

4、修飾幾乎涉及到結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞所有生理途徑，可能具有廣泛的影響性，其中大量乙?；牡鞍踪|(zhì)是與代謝途徑相關(guān)的。利用軟件motif-x對(duì)結(jié)核菌所有乙酰化的蛋白質(zhì)底物進(jìn)行了分析，鑒定出了6個(gè)呈現(xiàn)不同豐度的保守基序。通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘和文獻(xiàn)收集，我們從中選取了與結(jié)核分枝桿菌毒力、持留、抗生素耐受有密切聯(lián)系的異檸檬酸裂解酶作為下一步的研究對(duì)象，在恥垢分枝桿菌中表達(dá)純化結(jié)核菌異檸檬酸裂解酶并通過(guò)質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)其可以在322位賴(lài)氨酸（K）乙?；?，這與組學(xué)數(shù)據(jù)

5、鑒定的位點(diǎn)相一致。此外，定點(diǎn)突變乙?；稽c(diǎn)測(cè)定酶活性，發(fā)現(xiàn)體外模擬乙?；^(guò)程的K322Q突變蛋白的酶活性會(huì)大幅度降低，表明乙?；瘯?huì)抑制異檸檬酸裂解酶的活性，并影響細(xì)菌對(duì)抗生素的耐受。
　　⑵采用生物信息學(xué)的方法，對(duì)結(jié)核分枝桿菌中的已鑒定的和功能未知的乙?；高M(jìn)行了系統(tǒng)性分析，最終發(fā)現(xiàn)47個(gè)假定的或已鑒定的乙酰化酶，對(duì)其進(jìn)行功能分類(lèi)發(fā)現(xiàn)大多數(shù)乙酰化酶歸屬于中心代謝和呼吸類(lèi)。此外通過(guò)Blast等一系列生物信息學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)一些乙?；冈?/p>

6、機(jī)會(huì)性和非致病性分枝桿菌中存在同源蛋白質(zhì)。與結(jié)核分枝桿菌毒力基因數(shù)據(jù)比較分析，發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)乙酰化酶可能與毒力相關(guān)。交叉比較了乙?；笖?shù)據(jù)和已報(bào)道的其他PTMs組學(xué)數(shù)據(jù)，結(jié)果表明只有一種乙?；福琑v2215，既可以被乙酰化也可以被琥珀?；臀於；?，也發(fā)現(xiàn)一種乙酰化酶可以被乙?；?，琥珀?；臀於；揎?，此外，RT-PCR方法證明了許多乙?；缚赡芘c鄰近基因組成了同一操縱子。
　?、且詯u垢分枝桿菌作為模式生物和研究對(duì)象，利用免疫

7、親和富集和高靈敏度的質(zhì)譜聯(lián)用方法，對(duì)其乙?；鞍踪|(zhì)和乙?；稽c(diǎn)分布進(jìn)行了檢測(cè)，總共鑒定了345個(gè)乙?；鞍踪|(zhì)和620個(gè)乙酰化位點(diǎn)。生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)乙酰化蛋白質(zhì)具有廣泛的生物學(xué)功能和定位，鑒定了可能存在的6種乙酰化基序（KACH，KACY，KACF和F*KAC），并構(gòu)建了恥垢分枝桿菌第一張乙?；鞍踪|(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖譜，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)許多參與中心代謝的蛋白質(zhì)都被乙酰化。此外，我們構(gòu)建了乙?；窻v0998的同源蛋白質(zhì)MSMEG_5

8、458的基因缺失菌株，發(fā)現(xiàn)該蛋白可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)乙酰化狀態(tài)進(jìn)而影響對(duì)抗生素異煙肼和十二烷基磺酸鈉敏感性；氣相色譜-質(zhì)譜結(jié)果顯示賴(lài)氨酸乙酰化可以改變恥垢分枝桿菌大多數(shù)脂肪酸含量；通過(guò)差異蛋白質(zhì)乙?；M學(xué)方法發(fā)現(xiàn)了可能為MSEMG_5458的102個(gè)蛋白質(zhì)乙?；孜铮谶@些底物中包括參與分枝菌酸合成途徑與異煙肼耐受相關(guān)的inhA蛋白質(zhì)；定點(diǎn)突變方法和spot test實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示inhA的乙?；皇菍?dǎo)致缺失菌株對(duì)異煙肼耐受的原因；最后我們通過(guò)

9、測(cè)定野生型菌株和缺失菌株中NAD+和NADH含量，發(fā)現(xiàn)NAD+/NADH比列的下調(diào)是導(dǎo)致缺失菌株對(duì)異煙肼耐受的原因。
　　⑷利用抗賴(lài)氨酸戊二?；贵w的免疫親和富集以及質(zhì)譜聯(lián)合方法，鑒定了結(jié)核分枝桿菌中存在24個(gè)戊二?；鞍缀?1個(gè)戊二酰化位點(diǎn)，其中有許多戊二酰化蛋白在細(xì)菌中是第一次報(bào)道。我們發(fā)現(xiàn)戊二酰化蛋白參與多種生物學(xué)途徑，如代謝，應(yīng)激反應(yīng)。此外，與結(jié)核分枝桿菌中其他翻譯后修飾組學(xué)數(shù)據(jù)比較分析，發(fā)現(xiàn)有15個(gè)蛋白既可以被戊二?；?/p>

10、可以被乙酰化和琥珀?；Ｖ档米⒁獾氖?，一些與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的包括HspX在內(nèi)的蛋白質(zhì)被戊二?；?br>　?、裳芯苛髓F穩(wěn)態(tài)主要調(diào)控元件IdeR蛋白質(zhì)的上游調(diào)控sRNAs和下游所調(diào)控的靶標(biāo)sRNAs。首先通過(guò)文獻(xiàn)搜集和數(shù)據(jù)挖掘，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可能調(diào)控IdeR的sRNA，由IdeR編碼序列的反義鏈所編碼形成的順式編碼sRNA，ncRv2711c，并通過(guò)其特異性的DIG標(biāo)記探針進(jìn)行了Northern blot鑒定；隨后我們發(fā)展了一種可以快速、簡(jiǎn)單

11、、經(jīng)濟(jì)的鑒定sRNAs5’末端和3’末端的新方法RJEM，并以已知5’末端和3’末端的大腸桿菌RyhB和結(jié)核分枝桿菌Mcr7 sRNAs為研究對(duì)象，對(duì)該方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行了驗(yàn)證，并用該方法鑒定了ncRv2711c的5’末端和3’末端，確定了ncRv2711c的準(zhǔn)確長(zhǎng)度；我們構(gòu)建了可以在四環(huán)素誘導(dǎo)下過(guò)表達(dá)ncRv2711c的重組結(jié)核分枝桿菌（ST377）；通過(guò)測(cè)定其在不同培養(yǎng)基條件下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)ncRv2711c可以導(dǎo)致ST377

12、在高鐵環(huán)境培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)明顯受到抑制，而在低鐵環(huán)境培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)無(wú)多大影響；Western blot結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)ncRv2711c可以導(dǎo)致IdeR蛋白質(zhì)的水平下降，定量PCR結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)ncRv2711c可以導(dǎo)致鐵儲(chǔ)存蛋白質(zhì)bfrB的轉(zhuǎn)錄水平的下降，鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)MbtB轉(zhuǎn)錄水平上升；通過(guò)對(duì)低鐵和高鐵培養(yǎng)條件下的結(jié)核分枝桿菌全RNA測(cè)序，最終鑒定了85個(gè)和鐵應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)的差異性sRNAs；生物信息學(xué)分析顯示這些sRNAs的長(zhǎng)度大多數(shù)位于50-