結(jié)核分枝桿菌PPE家族基因Rv3425應(yīng)用于抗結(jié)核病疫苗的研究.pdf

1、結(jié)核病(Tuberculosis,TB)作為一種可治療和可預(yù)防的疾病,仍然導(dǎo)致每年200萬到300萬人死亡。而BCG保護(hù)效果的不穩(wěn)定(O～8096),HIV/AIDS的蔓延,發(fā)展中國家公共衛(wèi)生基礎(chǔ)設(shè)施的沒落以及耐多藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)導(dǎo)致結(jié)核病的迅速傳播?，F(xiàn)有的以疫苗接種和藥物治療為基礎(chǔ)的TB控制戰(zhàn)略也不能夠抑制這種疾病尤其是耐藥結(jié)核分枝桿菌的傳播。所以作為全球性健康干預(yù)措施,開發(fā)更有效的抗結(jié)核病疫苗刻不容緩。
　　 最近比較基

2、因組學(xué)和生物信息學(xué)表明除了RD1,還有11個(gè)基因組區(qū)域在結(jié)核分枝桿菌中保守存在,而在BCG疫苗株中是缺失的,這些缺失區(qū)包括了Mycobacterium tuberculosis H37Rv 108個(gè)ORFs。最近已經(jīng)有不少研究證明,RDl區(qū)和其他的RD區(qū)編碼的蛋白具有發(fā)展成為疫苗和診斷試劑的潛力。結(jié)核分枝桿菌基因組中大約有10％的ORFs編碼了PE和PPE家族蛋白,它們是富含甘氨酸且M.tuberculosis特有的蛋白。由于PE/PP

3、E家族蛋白在序列和可能結(jié)構(gòu)上的獨(dú)特性,推測(cè)它們有可能具有比較重要的免疫學(xué)意義。盡管這兩個(gè)大家族蛋白在抗結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng)中的作用研究得還不是很清楚,不過現(xiàn)在已經(jīng)有了一些關(guān)于PE/PPE蛋白免疫特性的報(bào)道。
　　 本項(xiàng)研究中基于BCG免疫缺陷原因的分析以及應(yīng)對(duì)策略選取了RD區(qū)中所有PPE家族蛋白(7個(gè)),經(jīng)過計(jì)算機(jī)分析以及文獻(xiàn)資料綜合評(píng)價(jià)選取了在M.tuberculosis中保守存在,而在BCG中缺失的PPE家族成員——Rv3

4、425,對(duì)其應(yīng)用于抗結(jié)核疫苗的潛力進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究工作主要包括以下幾部分:
　　 1.重組Rv3425蛋白免疫特性的研究。用純化的重組Rv3425蛋白100μg和弗氏不完全佐劑(incomplete freund's adjuvant,IFA)混合,隔周皮下免疫C57BL/6小鼠3次,單獨(dú)用IFA免疫作為對(duì)照,最后1次免疫3周后,分別通過ELISPOT和ELISA方法檢測(cè)脾細(xì)胞分泌IFN-γ的能力,IFN-γ,TNFα,IL-4的

5、分泌量,以及血清中特異性抗體的水平。結(jié)果表明經(jīng)過重組Rv3425蛋白免疫之后,小鼠血清中IgG(H+L)、IgG1、IgG2a抗體水平均有所增強(qiáng);免疫小鼠脾細(xì)胞受到特異性抗原刺激后,有較多的淋巴細(xì)胞可以分泌表達(dá)IFN-γ,并且Rv3425蛋白免疫組IFN-γ,TNFα的分泌量明顯高于IFA免疫對(duì)照組,而IL-4在兩個(gè)免疫組中都沒有檢測(cè)到。由此我們可以初步推論P(yáng)PE蛋白R(shí)v3425有較好的免疫特性,有可能應(yīng)用于抗結(jié)核疫苗的設(shè)計(jì)。
　

6、　 2.分泌表達(dá)Ag85B和Rv3425融合蛋白的重組BCG菌株的篩選和免疫學(xué)特性的研究。BCG是很好的活的疫苗載體,可以誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。將一些重要的結(jié)核分枝桿菌抗原基因?qū)隑CG,讓BCG大量表達(dá)保護(hù)性抗原,有望誘導(dǎo)比BCG強(qiáng)大而又持久的免疫保護(hù)力。結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液蛋白中的Ag85B是重要的保護(hù)性抗原,廣泛應(yīng)用于新型結(jié)核病疫苗研究。本研究選擇結(jié)核分枝桿菌重要保護(hù)性抗原Ag85B以及PPE抗原Rv3425,通

7、過穿梭質(zhì)粒pMV261重組入BCG,構(gòu)建了rBCG::Ag85B-Rv3425,該重組BCG是國內(nèi)外首次報(bào)道。
　　 用rBCG::Ag85B-Rv3425和BCG菌株免疫C57BL/6小鼠后,通過分析小鼠脾細(xì)胞IFNγ的分泌水平,CD4+、CD8+T細(xì)胞所占的比例以及抗體IgG水平、IgG2a/IgG1,比較了重組BCG和BCG的免疫原性。研究結(jié)果表明,rBCG::Ag85B-Rv3425免疫的小鼠可以引起較BCG免疫小鼠更多

8、的抗原特異性T細(xì)胞分泌IFN-γ。除此之外,rBCG::Ag85B-Rv3425免疫的小鼠體液水平也有明顯增強(qiáng),抗原特異性的IgG亞類分析發(fā)現(xiàn)在免疫之后的9周可以誘導(dǎo)出更高的IgG2a反應(yīng),暗示該重組疫苗引起的可能是具有保護(hù)性的Th1反應(yīng),這反過來又會(huì)促進(jìn)保護(hù)性因子IFN-γ的分泌,這是抗結(jié)核疫苗成功的重要因素。因此我們也可以初步推論該重組疫苗rBCG::Ag85B-Rv3425可能成為抗結(jié)核的潛在候選疫苗。
　　 3.重組疫苗

9、rBCG::Ag85B-Rv3425對(duì)小鼠動(dòng)物免疫保護(hù)效果的研究。皮下免疫C57BL/6小鼠,劑量為5×106cfu,9周后用結(jié)核分枝桿菌毒力標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv尾靜脈攻擊,攻擊劑量為1×106cfu。攻擊后6周,9周,12周,觀察小鼠脾、肺中菌落計(jì)數(shù)、組織病理變化以及小鼠的存活率和攻毒前后體重的變化。研究結(jié)果顯示rBCG::Ag85B-Rv3425免疫的小鼠肺部菌落數(shù)較BCG免疫組有差異(p＜0.05),抗酸染色顯示rBCG::Ag85B

10、-Rv3425免疫的小鼠肺部組織的結(jié)核桿菌數(shù)較BCG免疫組也少。我們可以看出,與BCG相比,rBCG::Ag85B-Rv3425能夠產(chǎn)生相當(dāng)甚至更好的保護(hù)作用。在我們的實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間內(nèi),BCG免疫組和rBCG::Ag85B-Rv3425免疫組在小鼠存活率方面沒有明顯差異,為此我們的重組疫苗小鼠毒力攻擊保護(hù)實(shí)驗(yàn)正在武漢大學(xué)三級(jí)生物安全動(dòng)物進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間毒力株攻擊后觀察來區(qū)分重組BCG與BCG疫苗的保護(hù)效率差異。
　　 綜上所述,PPE蛋