結(jié)核分枝桿菌抗原Rv3425及融合抗原Ag85B-Rv3425在結(jié)核疫苗中的治療和保護(hù)作用研究.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的重大傳染性疾病，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，全球有1/3的人口感染了結(jié)核分枝桿菌。近些年來(lái)，耐藥結(jié)核菌株的出現(xiàn)和HIV感染使得結(jié)核病的防治形勢(shì)更加嚴(yán)峻。目前臨床上應(yīng)用于治療結(jié)核感染的抗結(jié)核藥物存在治療周期長(zhǎng)，副作用大等諸多問(wèn)題，導(dǎo)致病人服藥的依從性很低，在一定程度上加劇了結(jié)核病的復(fù)發(fā)以及耐藥結(jié)核的產(chǎn)生;另一方面，人類(lèi)對(duì)于結(jié)核病的預(yù)防手段目前還只有接種卡介苗BCG一種方式，BCG疫苗對(duì)于不同人群的保護(hù)效果差異較大，而

2、且對(duì)成人幾乎沒(méi)有保護(hù)效果，所以其保護(hù)效果并不理想。因此，探索結(jié)核病治療新模式，研發(fā)延長(zhǎng)保護(hù)時(shí)間的新型結(jié)核疫苗，成為目前亟待解決的兩大問(wèn)題。
　　本論文著眼予以上兩大問(wèn)題，初步探究了新型的解決方案，主要包括以下兩部分:
　　1.慢病毒載體表達(dá)結(jié)核菌融合抗原Ag85B-Rv3425可以有效治療小鼠結(jié)核感染。
　　我們首次將慢病毒作為結(jié)核病治療性疫苗的載體，構(gòu)建相關(guān)載體并包裝出可以表達(dá)融合抗原Ag85B-Rv3425(簡(jiǎn)稱(chēng)A

3、3)的重組慢病毒，通過(guò)小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明重組慢病毒足墊單次免疫可以有效誘導(dǎo)融合抗原A3在小鼠體內(nèi)表達(dá)并激發(fā)相應(yīng)的免疫反應(yīng)。小鼠體內(nèi)表達(dá)的A3融合抗原經(jīng)過(guò)抗原遞呈識(shí)別過(guò)程，可以刺激特異性的T淋巴細(xì)胞增殖，增加小鼠體內(nèi)特異性CD4+，CD8+T淋巴細(xì)胞的比例，引發(fā)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)特異性抗原的Th1型免疫反應(yīng)，增強(qiáng)Th1型細(xì)胞因子IFN-gamma，IL-2的分泌表達(dá)，顯示出良好的抗結(jié)核潛力。
　　為了檢測(cè)重組慢病毒對(duì)于結(jié)核病的免疫治療效

4、果，我們利用尾靜脈攻毒方式對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行了結(jié)核菌感染，對(duì)感染后的小鼠進(jìn)行免疫治療實(shí)驗(yàn)，治療策略為通過(guò)足墊免疫的方式向小鼠體內(nèi)注射重組慢病毒，治療8周后，相對(duì)于對(duì)照小鼠，經(jīng)過(guò)重組慢病毒治療的小鼠肺臟內(nèi)的結(jié)核菌量下降了2/3，體重明顯上升，表明重組慢病毒對(duì)于感染小鼠體內(nèi)的結(jié)核菌具有清除作用，表達(dá)融合抗原A3的重組慢病毒表現(xiàn)出良好的結(jié)核病免疫治療前景。
　　2.表達(dá)融合抗原Ag85B-Rv3425的重組BCG初免，Rv3425

5、蛋白作為亞單位疫苗加強(qiáng)免疫可以取得顯著優(yōu)于BCG的保護(hù)效果。
　　為了尋找保護(hù)效果優(yōu)于BCG的免疫方案，我們采用了初免-加強(qiáng)的免疫策略，用一株免疫保護(hù)效果優(yōu)于BCG的表達(dá)融合抗原A3的重組BCG菌株進(jìn)行初免，分別用重組Ag85B，Rv3425進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫，借此來(lái)尋找最優(yōu)免疫策略。我們發(fā)現(xiàn)，用重組A3-BCG初免，用重組蛋白R(shí)v3425加強(qiáng)的免疫策略可以刺激小鼠脾臟中CD4+T淋巴細(xì)胞增殖，提高外周血PBMC中CD19+CD27

6、+記憶型B淋巴細(xì)胞的比例，延長(zhǎng)免疫反應(yīng)持續(xù)時(shí)間，從而在結(jié)核菌入侵時(shí)可以有效激發(fā)針對(duì)結(jié)核菌的特異性免疫反應(yīng)，對(duì)機(jī)體提供保護(hù)。
　　為了驗(yàn)證我們的免疫策略對(duì)于小鼠有保護(hù)作用，我們將免疫后的小鼠通過(guò)尾靜脈注射的方式進(jìn)行攻毒，攻毒后4周和8周分別對(duì)小鼠進(jìn)行肺臟和脾臟菌落計(jì)數(shù)。攻毒結(jié)果證明，相對(duì)于BCG，用重組A3-BCG初免，用重組蛋白R(shí)v3425加強(qiáng)的免疫策略對(duì)于小鼠的保護(hù)效果更加顯著。A3-BCG/Rv3425免疫策略可以有效降低肺臟