結(jié)核分枝桿菌cAMP誘導(dǎo)基因Rv1265在胞內(nèi)存活中的作用與分子機(jī)理.pdf

1、據(jù)2013 World Health Organization Tuberculosis Data and Statistics報(bào)道，結(jié)核病每年導(dǎo)致1.3 million死亡，新增8.6 million感染病例。由于藥物的廣泛濫用及亂用，使得結(jié)核病死灰復(fù)燃，嚴(yán)重危害著人類的健康，尤其是與HIV免疫缺陷病人共感染。多重耐藥菌（mutiple-drug resistance）和廣泛耐藥菌(extensive-drugresistance)的

2、出現(xiàn)使得結(jié)核病的治療更加困難。因此尋找結(jié)核分枝桿菌的新的藥物靶標(biāo)，篩選并開發(fā)新型抗結(jié)核藥物。目前結(jié)核分枝桿菌存在許多功能未知的保守蛋白，而這些蛋白對(duì)于結(jié)核分枝桿菌在宿主中的存活是否存在一定關(guān)聯(lián)，這些都需要做進(jìn)一步的探討。因此本文主要以恥垢分枝桿菌為模型，探索cAMP應(yīng)答基因rv1265在結(jié)核分枝桿菌毒力中的作用。
　　本研究成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pALACE-Rv1265，將其電轉(zhuǎn)到恥垢分枝桿菌后通過(guò)抗生素篩選和菌液PCR的方法鑒定重

3、組菌株Ms_Rv1265構(gòu)建成功。以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)存的空載菌株Ms_vector為對(duì)照，western blotting成功檢測(cè)到Ms_ Rv1265菌株中帶有His標(biāo)簽的Rv1265蛋白表達(dá)，而空載菌(Ms_Vec)在相應(yīng)的位置上沒(méi)有條帶。利用96孔板檢測(cè)Rv1265的過(guò)表達(dá)菌株對(duì)臨床上常用的抗結(jié)核藥物的耐受情況，發(fā)現(xiàn)與Ms_ Vec相比Ms_ Rv1265對(duì)抗生素的耐受性并沒(méi)有影響。生長(zhǎng)曲線測(cè)定發(fā)現(xiàn)Ms_Rv1265和Ms_Vec的生長(zhǎng)沒(méi)

4、有差異，說(shuō)明Rv1265的過(guò)表達(dá)不會(huì)影響恥垢分枝桿菌的生長(zhǎng)。細(xì)胞亞定位發(fā)現(xiàn)Rv1265蛋白定位在重組菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)中，推測(cè)該蛋白可能會(huì)改變重組菌的細(xì)胞壁性質(zhì)。因此我們提取Ms_Rv1265和Ms_Vec的脂肪酸，發(fā)現(xiàn)重組菌細(xì)胞壁的脂肪酸含量明顯高于空載菌，尤其是C10∶0，MeC13∶0, MeC14∶0, C15∶0, MeC15∶0, C16∶1We7(c), MeC16∶0,3MeC16∶0, C24∶1W9(c)和C26∶0

5、的含量顯著性上調(diào)，據(jù)此我們推測(cè)Rv1265可能參與了恥垢分枝桿菌脂肪酸的合成。C26∶0是分枝菌酸高溫分解的產(chǎn)物之一，而重組菌中C26∶0的增多也可能是因?yàn)橹亟M菌中分枝菌酸的含量增多引起的。體外模擬重組菌Ms_Rv1265和Ms_ Vec在表面活性物質(zhì)SDS和不同酸性條件下的存活，發(fā)現(xiàn)重組菌在0.1％ SDS處理下具有較強(qiáng)的存活率，并且相對(duì)于空載菌具有顯著性差異。在PH=3的7H9培養(yǎng)基里培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)與Ms_Vec相比，Ms_Rv1265

6、具有較強(qiáng)的存活率，而在PH=5的條件下，兩者沒(méi)有顯著性差異。為了進(jìn)一步探索Rv1265蛋白的毒力作用，利用Ms_Rv1265和Ms_ Vec侵染THP-1細(xì)胞和Raw264.7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Ms Rv1265在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力相對(duì)于Ms_ Vec具有顯著性提高，LDH釋放量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與Ms_Vec相比Ms_ Rv1265可以促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞的裂解。同時(shí)提取Raw264.7和THP-1細(xì)胞的總RNA，檢測(cè)相關(guān)的細(xì)胞因子IL-1β， I

7、L-6， IL-10，IL-12P40和TNF-a，以及炎癥相關(guān)的caspase-1和促凋亡因子bcl-rambo的轉(zhuǎn)錄水平。發(fā)現(xiàn)與Ms_Vec相比Ms_ Rv1265侵染后在Raw264.7和THP-1細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-1β，IL-12P40，IL-10和IL-6均上調(diào)表達(dá)。利用特異性的信號(hào)通路抑制劑處理侵染了Ms_ Rv1265和Ms_ Vec的細(xì)胞THP-1，發(fā)現(xiàn)NF-κB和1/2ERK途徑對(duì)于特異性誘導(dǎo)IL-1β，IL-12P