結(jié)核分枝桿菌Cas2(Rv2816c)在脅迫應(yīng)答及胞內(nèi)存活中的作用與分子機(jī)理.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，它仍然是中國乃至世界上威脅人類健康的重要傳染病。世界人口中大約有1/3是結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染者，每年死于結(jié)核病的人大約有130萬[1]。導(dǎo)致結(jié)核病難以攻克的主要原因是多重耐藥菌和廣泛耐藥菌的出現(xiàn)以及與HIV共感染。因此，需要對結(jié)核病的致病菌——結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行更加深入的基礎(chǔ)研究。
　　結(jié)核分枝桿菌在體外生長

2、的過程中面臨著病毒——噬菌體的威脅，噬菌體在地球上幾乎無處不在。面對噬菌體的威脅，細(xì)菌逐漸進(jìn)化出了一系列的抗噬菌體機(jī)制，例如:限制性內(nèi)切酶、流產(chǎn)感染[2]，以及clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat(CRISPR)系統(tǒng)。CRISPR系統(tǒng)是一個(gè)最近幾年發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌抗噬菌體機(jī)制，它存在于90％的古生菌以及40％的細(xì)菌基因組中[3，4]，它為細(xì)菌和古生菌提供了一套獲得性噬菌

3、體抵抗機(jī)制。CRISPR系統(tǒng)含有由一系列被非重復(fù)的間隔序列分散的短的重復(fù)序列。此外，它還包含一個(gè)前導(dǎo)序列和周圍CRISPR-相關(guān)的基因(CAS)[5]。不同的Cas蛋白的功能各不相同，例如核糖核酸酶、解旋酶、聚合酶等。最近有研究證明，CRISPR位點(diǎn)具有基因表達(dá)調(diào)控的功能[6]。Francisellanovicida的Cas9蛋白能夠調(diào)控編碼脂蛋白的基因FTN1103的表達(dá)[7]。CRISPR中與自身基因組中的DNA序列同源的間區(qū)被報(bào)道

4、與自身免疫及基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)[8，9]。
　　Cas2已經(jīng)被報(bào)道是一個(gè)在間區(qū)獲得過程中起重要作用的保守的RNA核酸內(nèi)切酶[10-12]，它廣泛分布于所有含有CRISPR序列的微生物基因組中[9，13，14]。Cas2對于L.pneumophila侵染其宿主Hartmannella和Acanthamoeba以及逃避巨噬細(xì)胞免疫非常重要[15]。結(jié)核分枝桿菌基因組中具有兩個(gè)串聯(lián)的CRISPR結(jié)構(gòu)，并且它們周圍有9個(gè)編碼CRISPR相關(guān)

5、的蛋白的基因，其中包括編碼Cas2的Rv2816c[12]。當(dāng)用抑制代謝的抑制劑，例如抗生素、引起壓力的試劑等處理結(jié)核分枝桿菌后，Rv2816c的轉(zhuǎn)錄水平會(huì)發(fā)生變化[16]。因此我們推測Rv2816c可能涉及到結(jié)核分枝桿菌的抗壓力反應(yīng)以及抗生素抗性。
　　本文通過將分枝桿菌Cas2的氨基酸序列與之前研究過的硫化葉菌（Sulfolobussolfataricus）的Cas2氨基酸序列進(jìn)行比對，找到分枝桿菌Cas2的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件以及它

6、的催化活性位點(diǎn)，且發(fā)現(xiàn)Cas2在致病分枝桿菌中是非常保守的。我們用恥垢分枝桿菌作為模式菌株構(gòu)建了過表達(dá)結(jié)核分枝桿菌Cas2(Rv2816c)的重組恥垢分枝桿菌M.smegmatis-pALACE-Rv2816c。對M.smegmatis-pALACE-Rv2816c表型進(jìn)行了觀察，并研究了Cas2對恥垢分枝桿菌胞外壓力反應(yīng)以及在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活率的影響。我們發(fā)現(xiàn)Cas2的表達(dá)改變了恥垢分枝桿菌的生長速率、單菌落形態(tài)、滑動(dòng)能力以及生物膜的形

7、成能力，這些表面形態(tài)的改變可能與Cas2引起的恥垢分枝桿菌細(xì)胞壁脂質(zhì)成分的改變有關(guān);此外，我們發(fā)現(xiàn)了Cas2引起的恥垢分枝桿菌壓力反應(yīng)的改變與SigB、SigE及SigH表達(dá)水平的改變有關(guān)。這三個(gè)Sigma因子涉及到分枝桿菌的壓力反應(yīng)以及毒力。我們還發(fā)現(xiàn)Cas2降低了M.smegmatis-pALACE-Rv2816c在巨噬細(xì)胞中的存活率，并伴隨著宿主細(xì)胞因子IL-6和IL-10的轉(zhuǎn)錄水平降低。我們的工作為Cas2功能的研究提供了新的方