結(jié)核分枝桿菌ESAT-6樣蛋白R(shí)v3904c(EsxE)在脅迫和免疫中的功能.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引發(fā)的結(jié)核病是世界上除艾滋病毒以外的單一病原體導(dǎo)致的致死率最高的疾病。近年來(lái)隨著醫(yī)藥技術(shù)的迅速發(fā)展，結(jié)核病的診斷和治療也取得了一些成效，但由于耐藥結(jié)核病、多耐藥結(jié)核病、廣泛耐藥結(jié)核病及結(jié)核病與艾滋病共感染的出現(xiàn)，使得結(jié)核病的診治難上加難，許多抗結(jié)核藥物不再對(duì)結(jié)核病的治療發(fā)揮作用，因而新的治療策略和藥物開(kāi)發(fā)迫在眉睫。
　　MTB可以破壞巨噬細(xì)胞的抗微生物途徑

2、，避免溶酶體的吞噬，且需要ESX特異性蛋白分泌系統(tǒng)介導(dǎo)毒力的產(chǎn)生，從而引起細(xì)胞天然免疫應(yīng)答。ESX-1分泌系統(tǒng)存在于多種放線菌中，能夠分泌早期抗原靶標(biāo) esat-6和 cfp-10蛋白，這兩個(gè)蛋白是MTB重要的毒力因子。而MTB基因組可編碼5個(gè)潛在的VII型分泌系統(tǒng)基因簇，它們有相似的基因序列，卻發(fā)揮著不同的功能。VII型分泌系統(tǒng)在MTB宿主-病原體互作過(guò)程中發(fā)揮重要功能，這可能為 MTB的預(yù)防、診斷和治療提供更好的研究策略。而早期抗原

3、靶標(biāo) esat-6則是作為早期診斷策略開(kāi)發(fā)的重要抗原靶標(biāo)。
　　Esat-6（早期分泌抗原靶6：early secretary antigen target6）是MTB的一個(gè)小分子的分泌蛋白，在MTB的毒力和保護(hù)性免疫中非常重要。Esat-6是MTB感染早期介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的主要的優(yōu)勢(shì)抗原，動(dòng)物或人感染MTB可以產(chǎn)生有免疫活性的T淋巴細(xì)胞識(shí)別 esat-6抗原，并可以產(chǎn)生高水平的IFN-γ。Esat-6蛋白屬于esat-6家族，該

4、家族蛋白約100個(gè)氨基酸殘基，在免疫應(yīng)答，尤其是早期免疫應(yīng)答中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。此外，該家族蛋白在MTB中約有23個(gè)成員（EsxA-W），除了EsxQ，其它基因均成對(duì)存在，其中一些高度相似，而其它的則保守性很低，有一個(gè)序列類(lèi)似的WXG（Trp-Xaa-Gly）基序，大多數(shù)功能未知。本研究中選取EsxE（Rv3904c），其中一個(gè)esat-6/WXG100家族的蛋白，研究EsxE在壓力和免疫應(yīng)答中的功能。我們從H37Rv基因組上體外擴(kuò)增

5、Rv3904c的基因片段，構(gòu)建重組菌株Ms-Rv3904c。7H9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)重組恥垢分枝桿菌 Ms-Rv3904c，加乙酰胺誘導(dǎo)Western blotting檢測(cè)EsxE蛋白的表達(dá)；以空載菌株Ms-Vec對(duì)照，分別檢測(cè)重組菌株在誘導(dǎo)條件下的生長(zhǎng)情況，生物膜形成差異；對(duì)抗生素諾氟沙星（Norfloxacin）、異煙肼（Isoniazid）、萬(wàn)古霉素（Vancomycin）和氧氟沙星（Ofloxacin）及表面活性物質(zhì)SDS的耐受情況

6、；重組菌侵染巨噬細(xì)胞后的存活能力，并用qRT-PCR法檢測(cè)了侵染后巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子的變化，進(jìn)一步了解重組菌在胞內(nèi)免疫應(yīng)答反應(yīng)。
　　綜上，本文中對(duì)esat-6家族蛋白EsxE進(jìn)行初步探索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EsxE蛋白在分枝桿菌中是保守的，對(duì)表面活性物質(zhì)SDS表現(xiàn)出很強(qiáng)的耐受性；而對(duì)抗結(jié)核藥物對(duì)諾氟沙星和異煙肼表現(xiàn)出不同程度的敏感性，特別是對(duì)諾氟沙星極其敏感。侵染染巨噬細(xì)胞后，EsxE蛋白的過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)重組菌在巨噬細(xì)胞中的存活，并在早期免