分泌表達(dá)結(jié)核分枝桿菌ESAT-6蛋白的重組BCG的構(gòu)建、表達(dá)及免疫學(xué)特性的初步研究.pdf

1、該研究首先將ESAT-6蛋白基因克隆到pDE<,22>載體中,構(gòu)建大腸桿菌-分枝桿菌穿梭分泌表達(dá)質(zhì)粒pDE<,22>-ESAT-6,電穿轉(zhuǎn)化BCG,構(gòu)建成分泌表達(dá)ESAT-6蛋白的rBCG菌株.7H9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)rBCG,收集培養(yǎng)上清,用Sephadex G-50凝膠層析粗分離ESAT-6蛋白,小分子蛋白的Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)ESAT-6,結(jié)果顯示有6kDa大小的條帶,表明所構(gòu)建的rBCG可分泌表達(dá)ESAT-6蛋白,且

2、dot blotting進(jìn)一步證實(shí)了目的蛋白的表達(dá).分別接種rBCG和普通BCG于7H9培養(yǎng)液中,37℃振搖培養(yǎng),測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的OD<,600nm>值,繪制生長(zhǎng)曲線.結(jié)果表明,rBCG的生長(zhǎng)特性與普通BCG無(wú)明顯差別.用分泌表達(dá)ESAT-6蛋白的rBCG和普通BCG分別經(jīng)背部皮下免疫BALB/c小鼠(免疫劑量均為106CFU),同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照組,免疫6w后,采用不同方法分別測(cè)定各組免疫小鼠的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫水平.ELISA

3、檢測(cè)各組小鼠血清中特異性抗體的結(jié)果表明,rBCG和BCG免疫組的小鼠均產(chǎn)生了抗MTB H37Rv株培養(yǎng)濾液蛋白(CFP)的高滴度抗體,且rBCG免疫組小鼠血清抗體滴度(1:8000)顯著高于BCG免疫組小鼠血清的抗體滴度(1:1400)(P<0.05).分離各免疫組小鼠的脾淋巴細(xì)胞,體外用抗原刺激,MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和檢測(cè)IFN-γ的產(chǎn)生水平.結(jié)果表明,rBCG免疫組的IFN-γ含量達(dá)到1993士105 pg/ml,明顯高于B

4、CG免疫組的1463士107 pg/ml(P<0.05),而生理鹽水對(duì)照組IFN-γ含量只有230士56 pg/ml;rBCG免疫組的脾淋巴細(xì)胞增殖顯著,其刺激指數(shù)為4.34,明顯高于BCG免疫組的脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)3.79(P<0.05),而生理鹽水對(duì)照組淋巴細(xì)胞的增殖不顯著,刺激指數(shù)只有1.33.綜上所述,分泌表達(dá)ESAT-6蛋白的rBCG與普通BCG相比可刺激更強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答,但其對(duì)MTB感染的保護(hù)性等還需進(jìn)一步的