結(jié)核分枝桿菌ClpP1重組蛋白的特性探討及初步應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)中ATP依賴的酪氨酸蛋白酶蛋白水解亞基(ATP-dependent caseinolytic proteaseproteolytic subunit，ClpP1)的原核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入E.coli中誘導(dǎo)表達(dá)和純化ClpP1重組蛋白，并通過應(yīng)激試驗(yàn)探討ClpP1重組蛋白的生物學(xué)特性;將純化的ClpP1重組蛋白免疫白兔制備相應(yīng)的多克隆抗體，間接E

2、LISA法分析制備抗體的的抗原反應(yīng)性，并初步評價(jià)其應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:
　　1.以Mtb(H37Rv)基因組為模板，用PCR法擴(kuò)增ClpP1片段，將其定向插入至pET32a(+)載體上，構(gòu)建ClpP1重組質(zhì)粒，并用雙酶切和DNA測序進(jìn)行驗(yàn)證。
　　2.將構(gòu)建成功的ClpP1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Ecoli BL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)ClpP1重組蛋白;經(jīng)Western-blot鑒定蛋白后，采用親和層析法純化目的蛋

3、白。
　　3.通過研究ClpP1重組蛋白對宿主菌的生長、耐高溫、抗氧化及生物膜形成等影響的應(yīng)激試驗(yàn)和以純化ClpP1重組蛋白為抗原的間接ELISA法一起探討ClpP1重組蛋白的特性。
　　4.用純化ClpP1重組蛋白免疫新西蘭白兔，制備ClpP1多克隆抗體及檢測其效價(jià)，并用BCG中ClpP1蛋白進(jìn)一步檢測多克隆抗體的特異性。
　　5.通過間接ELISA法，用制備的ClpP1多克隆抗體檢測結(jié)核病(tuberculosis

4、，TB)、哮喘、肺炎、慢性阻塞性肺氣腫(Chronic obstructivepulmonary disease，COPD)和肺癌患者血清中ClpP1抗原的水平，計(jì)算其檢測的敏感性和特異性。
　　結(jié)果:
　　1.重組質(zhì)粒pET-32a(+)-ClpP1經(jīng)雙酶切鑒定后，片段大小與理論值相符，測序結(jié)果與在Gene Bank中查找的序列一致。
　　2.重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析和Western-blot鑒定均發(fā)現(xiàn)在約35

5、kDa處出現(xiàn)特異性條帶;通過親和層析法分離和純化ClpP1重組蛋白后，BandScan軟件分析得出重組蛋白表達(dá)量約占總菌體蛋白的33％，且純化蛋白的濃度和純度分別為1.1mg/ml和93％。
　　3.通過應(yīng)激試驗(yàn)得出ClpP1重組蛋白具有促進(jìn)生長和幫助提高宿主菌對高溫及過氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)耐受能力的作用，而對生物膜的形成并未有促進(jìn)作用;ClpP1重組蛋白檢測結(jié)核病病人和健康人血清中的ClpP1抗

6、體水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組與對照組間具有顯著性差異。
　　4.用純化ClpP1重組蛋白免疫新西蘭白兔4次后，檢測其抗體效價(jià)為1∶640000;Western-blot結(jié)果顯示制備的抗體可較好地與BCG中ClpP1蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。
　　5.用制備的ClpP1多克隆抗體檢測結(jié)核病、哮喘、肺炎、慢性阻塞性肺氣腫和肺癌患者血清中ClpP1抗原水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示結(jié)核病組與其他疾病組間差異顯著，且檢測的敏感性和特異性分別為69.9％