結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞活性氧爆發(fā)機(jī)制的初步探討.pdf

1、研究背景：中性粒細(xì)胞即多形核細(xì)胞（polymorphonuclear cells, PMNs）是機(jī)體承擔(dān)固有免疫的主要細(xì)胞之一，構(gòu)成了免疫防御機(jī)制的第一道防線。PMN防御系統(tǒng)中最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)是通過呼吸氧爆發(fā)過程中產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)即ROS爆發(fā)，其細(xì)胞內(nèi)抑菌殺菌作用與NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生ROS直接相關(guān)。目前有研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體抗結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tubercul

2、osis, Mtb)感染的過程中，PMN起著重要的免疫保護(hù)作用，有證據(jù)顯示PMN吞噬Mtb后通過釋放ROS達(dá)到殺死Mtb的目的，但其機(jī)制卻不明確。探討Mtb誘導(dǎo)PMN活性氧爆發(fā)機(jī)制，在抗結(jié)核感染的天然免疫作用，對(duì)于全面了解機(jī)體抗結(jié)核感染的免疫保護(hù)機(jī)制，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　目的：建立流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人外周血PMN感染Mtb時(shí)ROS產(chǎn)生；觀察不同的信號(hào)阻斷劑對(duì)PMN感染Mtb時(shí)ROS產(chǎn)生的影響，了解所涉及信號(hào)通路。<

3、br>　　方法：
　　1.取健康人外周血標(biāo)本加入雙氫羅丹明（DHR）或2′,7′二氯二氫熒光素二酯酸（DCFH-DA）37℃孵育15 min后，分別再加佛波醇酯（Phorbo12-myristate13-acetate, PMA）、Mtb、大腸埃希菌（Ecoli）混勻，置37℃水浴5～90 min，經(jīng)溶血和洗滌后，PBS重懸，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PMN內(nèi)的羅丹明123(rhodamine123, RHO)或氧化型二氯熒光素(dichlo

4、rofluorecin, DCF)的熒光強(qiáng)度。
　　2.取健康人外周血用Percoll分離獲得PMN，加DHR或DCFH-DA37℃孵育15 min后，分別與PMA、Mtb、Ecoli混勻，置37℃水浴5～90 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PMN內(nèi)RHO或DCF的熒光強(qiáng)度。
　　3.取健康人外周血和DHR37℃孵育15 min后，與PMA相混合，置37℃水浴5～90 min，溶血和洗滌，分別用磷酸鹽緩沖液（PBS, pH7.2）、

5、1％甲醛重懸、1%多聚甲醛（Paraformaldehyde,1%PFA）重懸，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PMN內(nèi)RHO的熒光強(qiáng)度。
　　4.取健康人外周血預(yù)先分別加ERK1/2阻斷劑U0126、MAPKp38阻斷劑SB203580或PKC阻斷劑GF109203x孵育30 min，再加DHR37℃孵育15 min，然后分別再加PMA、Mtb、Ecoli混勻，置37℃水浴。30 min對(duì)PMA刺激組進(jìn)行溶血和洗滌，PBS重懸；60 min對(duì)Mt

6、b、Ecoli刺激組進(jìn)行溶血和洗滌，PBS重懸，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PMN內(nèi)RHO的熒光強(qiáng)度，并與對(duì)照組比較RHO的熒光強(qiáng)度變化情況。
　　結(jié)果:
　　1.以DHR為熒光探針時(shí)，全血標(biāo)本或分離PMN經(jīng)PMA刺激后產(chǎn)生ROS的時(shí)間動(dòng)力學(xué)相似，在37℃作用5～60 min時(shí)ROS量呈遞增趨勢(shì)，且在60 min左右達(dá)到峰值，60～90 min時(shí)漸下降。分離PMN比刺激全血標(biāo)本產(chǎn)生ROS峰值高。以DHR為熒光探針時(shí)，Mtb、Ecoli刺激

7、全血或分離PMN產(chǎn)生ROS的時(shí)間動(dòng)力學(xué)相似，在37℃作用5～90 min時(shí)ROS量呈遞增趨勢(shì)。
　　2.以DCFH-DA為熒光探針時(shí)，PMA、Mtb、Ecoli刺激全血PMN產(chǎn)生ROS的時(shí)間動(dòng)力學(xué)相似，在37℃作用5 min時(shí)ROS量達(dá)到峰值，隨后出現(xiàn)明顯遞減趨勢(shì)，而PMA刺激分離PMN產(chǎn)生ROS量在5～30 min時(shí)逐漸增高并在60～90 min時(shí)達(dá)平臺(tái)期，Mtb、Ecoli刺激分離PMN產(chǎn)生ROS在5～90 min時(shí)逐漸增高。

8、
　　3.人外周血與PMA在37℃水浴作用不同時(shí)間段，與PBS重懸組比較，1%甲醛、1%PFA均可顯著降低胞內(nèi)RHO的熒光強(qiáng)度，兩者之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4. ERK1/2阻斷劑U0126、MAPKp38阻斷劑SB203580和PKC阻斷劑GF109203x均可降低PMA、Mtb、Ecoli刺激PMN的RHO熒光強(qiáng)度。
　　結(jié)論：
　　1.用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PMN呼吸爆發(fā)時(shí)ROS產(chǎn)生，熒光探針DHR比DCF

9、H-DA更穩(wěn)定、敏感。
　　2. DHR探針檢測(cè)PMN呼吸爆發(fā)時(shí)ROS產(chǎn)生，全血標(biāo)本與分離PMN標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果相似，但PMA刺激分離PMN的ROS峰值明顯高于全血標(biāo)本。DCFH探針檢測(cè)Mtb、Ecoli刺激全血標(biāo)本時(shí)，PMN產(chǎn)生ROS的動(dòng)力學(xué)與PMA刺激時(shí)相似。
　　3. Mtb刺激比Ecoli刺激PMN產(chǎn)生更多ROS，提示Mtb激活PMN產(chǎn)生更多的殺菌活性物質(zhì)。
　　4.含甲醛的試劑對(duì)PMN的ROS產(chǎn)生有明顯降低作用