結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)FoxP T3+reg細(xì)胞增殖機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)核病(tuberculosis)仍是世界人均患病率和死亡率最高的傳染病，而多重耐藥結(jié)核菌株尤其是廣泛耐藥結(jié)核菌株的出現(xiàn)和傳播，為結(jié)核病的治療帶來了巨大困難。世界衛(wèi)生組織在2009年全球結(jié)核控制報(bào)告中指出:根據(jù)2007年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,中國結(jié)核病發(fā)病病例及耐藥性結(jié)核病例數(shù)在全世界196個(gè)國家和地區(qū)中排名第二。所以結(jié)核病的預(yù)防和控制在我國尤為重要。機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌（mycobacteriumtuberculosis，MTB）后，主要通過

2、一系列免疫細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)（如巨噬細(xì)胞、Th細(xì)胞、NK細(xì)胞等）及細(xì)胞因子（如INF-γ、TNF-α等）通過不同免疫機(jī)制（如巨噬細(xì)胞吞噬、細(xì)胞毒作用、細(xì)胞凋亡作用等）對(duì)結(jié)核菌進(jìn)行免疫清除。但實(shí)際上，機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后，機(jī)體很難將結(jié)核分枝桿菌徹底清除，據(jù)統(tǒng)計(jì)90％以上處于慢性感染狀態(tài)，5%處于活動(dòng)性結(jié)核，5%治療后反復(fù)發(fā)作，給人們健康產(chǎn)生極大威脅。MTB侵入機(jī)體后，如何逃避機(jī)體免疫清除，在機(jī)體長(zhǎng)期潛伏，并在機(jī)體免疫狀態(tài)低下時(shí)復(fù)燃，機(jī)制尚不完全清

3、楚。以叉狀頭／翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead/wingedhelixtranscriptionfactor,Foxp3)表達(dá)陽性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatoryTcells,FoxP3+Treg)在維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)起重要作用，F(xiàn)oxP3主要表達(dá)于CD4+CD25+high細(xì)胞上，是具有抑制功能CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，屬于“職業(yè)抑制性T細(xì)胞”，以細(xì)胞接觸機(jī)制與細(xì)胞因子介導(dǎo)機(jī)制發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)，近年來有研究發(fā)現(xiàn)FoxP3+調(diào)節(jié)性T

4、細(xì)胞與結(jié)核病有關(guān)，基于上述理論基礎(chǔ)，本研究將探討結(jié)核菌負(fù)荷與FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的相關(guān)性，以及通過體外細(xì)胞培養(yǎng)研究結(jié)核分枝桿菌對(duì)FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫誘導(dǎo)作用，進(jìn)一步明確結(jié)核分枝桿菌的免疫逃避機(jī)制，將有助于尋找結(jié)核病防治的新對(duì)策和新思路。
　　第一部分潮汕地區(qū)結(jié)核分枝桿菌耐藥譜初步分析
　　目的：探討潮汕地區(qū)結(jié)核病患者的耐藥狀況及耐藥譜，為耐藥結(jié)核的監(jiān)測(cè)提供參考依據(jù)。
　　方法：對(duì)2009年—2011年汕頭

5、市第三人民醫(yī)院收治結(jié)核病患者的臨床分離菌株進(jìn)行PNB、TCH菌種鑒定，并對(duì)分離菌株進(jìn)行十種抗結(jié)核藥物：INH、RFP、SM、EMB、CPM、OF、TH1321、PAS、KM、RFT藥物敏感試驗(yàn)，采用X檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。2
　　結(jié)果：①結(jié)核病患者分離菌株總耐藥率為36.3%(397/1093),耐二種抗結(jié)核藥(INH+RFP)以上為26.9%(294/1093),耐三種抗結(jié)核藥(INH+RFP+SM)以上的為18.1%(198/10

6、93),全耐藥達(dá)到5.6%(61/1093)。②初治或復(fù)治結(jié)核病患者分離菌株中結(jié)核分枝桿菌占92.5%(1011/1093),非結(jié)核分枝桿菌占7.5%(82/1093)。其中結(jié)核分枝桿菌菌株總耐藥率為31.3%(317/1011),耐二種抗結(jié)核藥(INH+RFP)以上為21.2%(214/1011),耐三種抗結(jié)核藥(INH+RFP+SM)以上的為11.7%(118/1011),全耐藥的達(dá)到0.3%(3/1011);非結(jié)核分枝桿菌菌株總耐

7、藥率為97.6%(80/82),耐二種抗結(jié)核藥(INH+RFP)以上為96.3%(79/82),耐三種抗結(jié)核藥(INH+RFP+SM)以上的為93.9%(77/89),全耐藥的達(dá)到69.5%(57/82)；③藥敏譜中，以異煙肼(PNH)耐藥率最高(36.3%)，利福平(RFP)及利福噴丁(RFT)次之(30.5%,30.6%)，對(duì)氨基水楊酸(PAS)耐藥率(10.2%)最低。④十種抗結(jié)核藥中，女性結(jié)核病患者耐藥率均高于男性；中老年結(jié)核病

8、患者耐藥率高于青少年；⑤全耐藥的年齡構(gòu)成比中，以30-60年齡段為主，占52.0%,30歲以下的比例最少，占7.0%。
　　結(jié)論：潮汕地區(qū)結(jié)核病患者耐藥情況嚴(yán)重，尤其是耐多藥現(xiàn)象更為嚴(yán)重，須進(jìn)一步加強(qiáng)耐藥結(jié)核的監(jiān)測(cè)。
　　第二部分活動(dòng)性肺結(jié)核病患者外周血淋巴細(xì)胞亞群分析
　　目的：檢測(cè)分析活動(dòng)性肺結(jié)核病患者外周血淋巴細(xì)胞亞群：T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞，NK細(xì)胞，以及共刺激分子CD28/CD152的變化并探討其臨床意義。<

9、br>　　方法：采集21例初診活動(dòng)性結(jié)核病患者及15例健康對(duì)照者外周血，采用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析淋巴細(xì)胞亞群：T淋巴細(xì)胞（CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+）亞群，B淋巴細(xì)胞（CD19+）亞群,NK細(xì)胞（CD3-/CD(16+56)+）,以及共刺激分子CD28/CD152的表達(dá)。
　　結(jié)果：與健康者比較，活動(dòng)性結(jié)核病患者外周血CD3+細(xì)胞,CD3+CD4+細(xì)胞水平及CD3+CD4+/CD3+CD8+比率明顯下降，有統(tǒng)

10、計(jì)學(xué)意義(p<0.01),而CD3+CD8+細(xì)胞水平明顯上升(p=0.003)。B淋巴細(xì)胞（CD19+）水平及共刺激分子CD28、CD152水平明顯上升，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。NK細(xì)胞(CD3-/CD(16+56)+)比例沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。對(duì)共刺激分子CD28、CD152進(jìn)行亞群分析,在活動(dòng)性結(jié)核病患者外周血CD4+CD152+細(xì)胞水平、CD8+CD28+細(xì)胞水平、CD8CD152細(xì)胞水平均明顯上升，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

11、意義++(p<0.05),而CD4+CD28+細(xì)胞水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
　　結(jié)論：活動(dòng)性結(jié)核病患者細(xì)胞免疫平衡紊亂，監(jiān)測(cè)活動(dòng)性結(jié)核病患者外周血淋巴細(xì)胞亞群水平，對(duì)評(píng)價(jià)患者的細(xì)胞免疫功能及對(duì)疾病免疫治療均有重要臨床指導(dǎo)意義。
　　第三部分耐藥性空洞型肺結(jié)核病患者手術(shù)前后FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的研究
　　目的：檢測(cè)分析耐藥性空洞型肺結(jié)核病患者手術(shù)前后外周血FoxP3調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞+(CD4CD25FoxP

12、3)水平的改變及臨床意義。
　　方法：分別于13例耐藥性空洞型肺結(jié)核病患者手術(shù)治療前、手術(shù)治療后1個(gè)月以及手術(shù)治療后6個(gè)月采集外周血及10例健康對(duì)照者外周血，采用多參數(shù)免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析CD4CD25細(xì)胞及CD4CD25FoxP3細(xì)胞水平。+high+++
　　結(jié)果：①與健康者比較，耐藥性空洞型肺結(jié)核病患者手術(shù)前外周血CD4，CD4CD25T淋巴細(xì)胞水平明顯下降（p<0.01），而CD4CD25細(xì)胞，CD4CD25細(xì)

13、胞及CD4CD25FoxP3+++high+++細(xì)胞水平明顯上升（p<0.01）；術(shù)后1個(gè)月，CD4+，CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞水平與健康者比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；D4CD25細(xì)胞，CD4CD25細(xì)胞及CD4CD25FoxP3細(xì)胞水平明C+++high+++顯升高（p<0.01）；術(shù)后6個(gè)月，CD4細(xì)胞、CD4CD25細(xì)胞、CD4CD25細(xì)胞、CD4CD25++++-+high細(xì)胞及CD4CD25FoxP3細(xì)胞水平與健康者比較差別均無

14、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。②與手+++術(shù)前比較，耐藥性空洞型結(jié)核病患者行手術(shù)治療后1個(gè)月和6個(gè)月，CD4，CD4CD25T++-淋巴細(xì)胞水平明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）;CD4+CD25+細(xì)胞，CD4+CD25high細(xì)胞及CD4CD25FoxP3細(xì)胞水平明顯下降，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）；③與術(shù)后1個(gè)月+++比較，術(shù)后6個(gè)月CD4細(xì)胞、CD4CD25細(xì)胞、CD4CD25細(xì)胞水平之間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意++-++義（p

15、>0.05）；CD4CD25細(xì)胞及CD4CD25FoxP3細(xì)胞水平明顯下降，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)+high+++意義（p<0.01）。④CD4CD25細(xì)胞與CD4CD25FoxP3細(xì)胞水平之間存在高度正相關(guān)性+high+++（p<0.01,r=0.878）。
　　+++結(jié)論：耐藥性空洞型肺結(jié)核病患者外周血FoxP3調(diào)節(jié)性Ｔ細(xì)胞水平明顯升高，有效手術(shù)治療后明顯下降，F(xiàn)oxP3調(diào)節(jié)性Ｔ細(xì)胞增殖可能與結(jié)核分枝桿菌的刺激誘導(dǎo)有關(guān)，且其表達(dá)水平可

16、能與結(jié)核分枝桿菌載量有關(guān)，F(xiàn)oxP3調(diào)節(jié)性Ｔ細(xì)胞在結(jié)核分枝桿菌的免疫逃避中起重要作用。
　　第四部分結(jié)核分枝桿菌特異性分泌蛋白ESAT-6、Ag85B對(duì)FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫誘導(dǎo)作用
　　目的：探討分析結(jié)核分枝桿菌特異性分泌蛋白ESAT-6、Ag85B對(duì)FoxP3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞+的免疫誘導(dǎo)作用。
　　方法：采集耐藥性結(jié)核病患者(MDR-TB)、潛伏感染者(LITB)及健康者(uninfectcontrols)各2

17、例外周血，采用不同濃度梯度的ESAT-6、Ag85B、BCG進(jìn)行刺激培養(yǎng)，培養(yǎng)終濃度為（0ug/ml、1ug/ml、2ug/ml、4ug/ml），PHA為陽性對(duì)照，并分別于培養(yǎng)后（0h、24h、48h、72h）時(shí)間點(diǎn)收集上清液及培養(yǎng)細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析培養(yǎng)細(xì)胞中CD4+CD25+FoxP3+細(xì)胞的量，以及RT-PCR檢測(cè)分析FoxP3的mRNA水平。
　　結(jié)果：①受ESAT6、Ag85B刺激培養(yǎng)后，CD4+CD25+Fox

18、P3+細(xì)胞的量及FOXP3mRNA水平均能明顯升高，健康者與潛伏感染者CD4+CD25+FoxP3+細(xì)胞的量及FOXP3mRNA水平均明顯高于BCG的刺激；②受ESAT6、Ag85B刺激培養(yǎng)后，耐藥性結(jié)核病患者與潛伏感染者CD4+CD25+FoxP3+細(xì)胞增加的量明顯高于健康者；但隱性感染者FOXP3mRNA增加的量卻明顯高于耐藥性結(jié)核病患者。③ESAT-6、Ag85B濃度增加，CD4+CD25+FoxP3+細(xì)胞量與FOXP3mRNA表

19、達(dá)呈上升趨勢(shì)；在有效培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，72h時(shí)間點(diǎn)，CD4+CD25+FoxP3+細(xì)胞量與FOXP3mRNA表達(dá)最高。
　　結(jié)論：①結(jié)核分枝桿菌能通過特異性分泌蛋白ESAT-6、Ag85B誘導(dǎo)刺激CD4+CD25+FoxP3+細(xì)胞增殖及FOXP3mRNA轉(zhuǎn)錄，且其量可能與其濃度存在正相關(guān)，從側(cè)面證實(shí)了結(jié)核病患者外周血CD4+CD25+FoxP3+細(xì)胞量增高程度與機(jī)體結(jié)核分枝菌載量有關(guān)。②潛伏感染者FOXP3mRNA更容易受ESAT-6、