結(jié)核分枝桿菌誘導FoxP T3+reg細胞增殖機制研究.pdf

1、結(jié)核病(tuberculosis)仍是世界人均患病率和死亡率最高的傳染病，而多重耐藥結(jié)核菌株尤其是廣泛耐藥結(jié)核菌株的出現(xiàn)和傳播，為結(jié)核病的治療帶來了巨大困難。世界衛(wèi)生組織在2009年全球結(jié)核控制報告中指出:根據(jù)2007年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,中國結(jié)核病發(fā)病病例及耐藥性結(jié)核病例數(shù)在全世界196個國家和地區(qū)中排名第二。所以結(jié)核病的預防和控制在我國尤為重要。機體感染結(jié)核分枝桿菌（mycobacteriumtuberculosis，MTB）后，主要通過

2、一系列免疫細胞網(wǎng)絡(luò)（如巨噬細胞、Th細胞、NK細胞等）及細胞因子（如INF-γ、TNF-α等）通過不同免疫機制（如巨噬細胞吞噬、細胞毒作用、細胞凋亡作用等）對結(jié)核菌進行免疫清除。但實際上，機體感染結(jié)核分枝桿菌后，機體很難將結(jié)核分枝桿菌徹底清除，據(jù)統(tǒng)計90％以上處于慢性感染狀態(tài)，5%處于活動性結(jié)核，5%治療后反復發(fā)作，給人們健康產(chǎn)生極大威脅。MTB侵入機體后，如何逃避機體免疫清除，在機體長期潛伏，并在機體免疫狀態(tài)低下時復燃，機制尚不完全清

3、楚。以叉狀頭／翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead/wingedhelixtranscriptionfactor,Foxp3)表達陽性調(diào)節(jié)性T細胞(regulatoryTcells,FoxP3+Treg)在維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)起重要作用，F(xiàn)oxP3主要表達于CD4+CD25+high細胞上，是具有抑制功能CD4+T淋巴細胞亞群，屬于“職業(yè)抑制性T細胞”，以細胞接觸機制與細胞因子介導機制發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)，近年來有研究發(fā)現(xiàn)FoxP3+調(diào)節(jié)性T

4、細胞與結(jié)核病有關(guān)，基于上述理論基礎(chǔ)，本研究將探討結(jié)核菌負荷與FoxP3+調(diào)節(jié)性T細胞的相關(guān)性，以及通過體外細胞培養(yǎng)研究結(jié)核分枝桿菌對FoxP3+調(diào)節(jié)性T細胞的免疫誘導作用，進一步明確結(jié)核分枝桿菌的免疫逃避機制，將有助于尋找結(jié)核病防治的新對策和新思路。
　　第一部分潮汕地區(qū)結(jié)核分枝桿菌耐藥譜初步分析
　　目的：探討潮汕地區(qū)結(jié)核病患者的耐藥狀況及耐藥譜，為耐藥結(jié)核的監(jiān)測提供參考依據(jù)。
　　方法：對2009年—2011年汕頭

5、市第三人民醫(yī)院收治結(jié)核病患者的臨床分離菌株進行PNB、TCH菌種鑒定，并對分離菌株進行十種抗結(jié)核藥物：INH、RFP、SM、EMB、CPM、OF、TH1321、PAS、KM、RFT藥物敏感試驗，采用X檢驗統(tǒng)計分析結(jié)果。2
　　結(jié)果：①結(jié)核病患者分離菌株總耐藥率為36.3%(397/1093),耐二種抗結(jié)核藥(INH+RFP)以上為26.9%(294/1093),耐三種抗結(jié)核藥(INH+RFP+SM)以上的為18.1%(198/10

6、93),全耐藥達到5.6%(61/1093)。②初治或復治結(jié)核病患者分離菌株中結(jié)核分枝桿菌占92.5%(1011/1093),非結(jié)核分枝桿菌占7.5%(82/1093)。其中結(jié)核分枝桿菌菌株總耐藥率為31.3%(317/1011),耐二種抗結(jié)核藥(INH+RFP)以上為21.2%(214/1011),耐三種抗結(jié)核藥(INH+RFP+SM)以上的為11.7%(118/1011),全耐藥的達到0.3%(3/1011);非結(jié)核分枝桿菌菌株總耐

7、藥率為97.6%(80/82),耐二種抗結(jié)核藥(INH+RFP)以上為96.3%(79/82),耐三種抗結(jié)核藥(INH+RFP+SM)以上的為93.9%(77/89),全耐藥的達到69.5%(57/82)；③藥敏譜中，以異煙肼(PNH)耐藥率最高(36.3%)，利福平(RFP)及利福噴丁(RFT)次之(30.5%,30.6%)，對氨基水楊酸(PAS)耐藥率(10.2%)最低。④十種抗結(jié)核藥中，女性結(jié)核病患者耐藥率均高于男性；中老年結(jié)核病

8、患者耐藥率高于青少年；⑤全耐藥的年齡構(gòu)成比中，以30-60年齡段為主，占52.0%,30歲以下的比例最少，占7.0%。
　　結(jié)論：潮汕地區(qū)結(jié)核病患者耐藥情況嚴重，尤其是耐多藥現(xiàn)象更為嚴重，須進一步加強耐藥結(jié)核的監(jiān)測。
　　第二部分活動性肺結(jié)核病患者外周血淋巴細胞亞群分析
　　目的：檢測分析活動性肺結(jié)核病患者外周血淋巴細胞亞群：T淋巴細胞，B淋巴細胞，NK細胞，以及共刺激分子CD28/CD152的變化并探討其臨床意義。<

9、br>　　方法：采集21例初診活動性結(jié)核病患者及15例健康對照者外周血，采用多參數(shù)流式細胞術(shù)檢測分析淋巴細胞亞群：T淋巴細胞（CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+）亞群，B淋巴細胞（CD19+）亞群,NK細胞（CD3-/CD(16+56)+）,以及共刺激分子CD28/CD152的表達。
　　結(jié)果：與健康者比較，活動性結(jié)核病患者外周血CD3+細胞,CD3+CD4+細胞水平及CD3+CD4+/CD3+CD8+比率明顯下降，有統(tǒng)

10、計學意義(p<0.01),而CD3+CD8+細胞水平明顯上升(p=0.003)。B淋巴細胞（CD19+）水平及共刺激分子CD28、CD152水平明顯上升，均具有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。NK細胞(CD3-/CD(16+56)+)比例沒有統(tǒng)計學意義(p>0.05)。對共刺激分子CD28、CD152進行亞群分析,在活動性結(jié)核病患者外周血CD4+CD152+細胞水平、CD8+CD28+細胞水平、CD8CD152細胞水平均明顯上升，具有統(tǒng)計學

11、意義++(p<0.05),而CD4+CD28+細胞水平無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。
　　結(jié)論：活動性結(jié)核病患者細胞免疫平衡紊亂，監(jiān)測活動性結(jié)核病患者外周血淋巴細胞亞群水平，對評價患者的細胞免疫功能及對疾病免疫治療均有重要臨床指導意義。
　　第三部分耐藥性空洞型肺結(jié)核病患者手術(shù)前后FoxP3+調(diào)節(jié)性T細胞的研究
　　目的：檢測分析耐藥性空洞型肺結(jié)核病患者手術(shù)前后外周血FoxP3調(diào)節(jié)性T淋巴細胞+(CD4CD25FoxP

12、3)水平的改變及臨床意義。
　　方法：分別于13例耐藥性空洞型肺結(jié)核病患者手術(shù)治療前、手術(shù)治療后1個月以及手術(shù)治療后6個月采集外周血及10例健康對照者外周血，采用多參數(shù)免疫熒光流式細胞術(shù)檢測分析CD4CD25細胞及CD4CD25FoxP3細胞水平。+high+++
　　結(jié)果：①與健康者比較，耐藥性空洞型肺結(jié)核病患者手術(shù)前外周血CD4，CD4CD25T淋巴細胞水平明顯下降（p<0.01），而CD4CD25細胞，CD4CD25細

13、胞及CD4CD25FoxP3+++high+++細胞水平明顯上升（p<0.01）；術(shù)后1個月，CD4+，CD4+CD25-T淋巴細胞水平與健康者比較差別無統(tǒng)計學意義；D4CD25細胞，CD4CD25細胞及CD4CD25FoxP3細胞水平明C+++high+++顯升高（p<0.01）；術(shù)后6個月，CD4細胞、CD4CD25細胞、CD4CD25細胞、CD4CD25++++-+high細胞及CD4CD25FoxP3細胞水平與健康者比較差別均無

14、統(tǒng)計學意義（p>0.05）。②與手+++術(shù)前比較，耐藥性空洞型結(jié)核病患者行手術(shù)治療后1個月和6個月，CD4，CD4CD25T++-淋巴細胞水平明顯升高，具有統(tǒng)計學意義（p<0.01）;CD4+CD25+細胞，CD4+CD25high細胞及CD4CD25FoxP3細胞水平明顯下降，均具有統(tǒng)計學意義（p<0.01）；③與術(shù)后1個月+++比較，術(shù)后6個月CD4細胞、CD4CD25細胞、CD4CD25細胞水平之間的差別無統(tǒng)計學意++-++義（p

15、>0.05）；CD4CD25細胞及CD4CD25FoxP3細胞水平明顯下降，差別具有統(tǒng)計學+high+++意義（p<0.01）。④CD4CD25細胞與CD4CD25FoxP3細胞水平之間存在高度正相關(guān)性+high+++（p<0.01,r=0.878）。
　　+++結(jié)論：耐藥性空洞型肺結(jié)核病患者外周血FoxP3調(diào)節(jié)性Ｔ細胞水平明顯升高，有效手術(shù)治療后明顯下降，F(xiàn)oxP3調(diào)節(jié)性Ｔ細胞增殖可能與結(jié)核分枝桿菌的刺激誘導有關(guān)，且其表達水平可

16、能與結(jié)核分枝桿菌載量有關(guān)，F(xiàn)oxP3調(diào)節(jié)性Ｔ細胞在結(jié)核分枝桿菌的免疫逃避中起重要作用。
　　第四部分結(jié)核分枝桿菌特異性分泌蛋白ESAT-6、Ag85B對FoxP3+調(diào)節(jié)性T細胞的免疫誘導作用
　　目的：探討分析結(jié)核分枝桿菌特異性分泌蛋白ESAT-6、Ag85B對FoxP3調(diào)節(jié)性T細胞+的免疫誘導作用。
　　方法：采集耐藥性結(jié)核病患者(MDR-TB)、潛伏感染者(LITB)及健康者(uninfectcontrols)各2

17、例外周血，采用不同濃度梯度的ESAT-6、Ag85B、BCG進行刺激培養(yǎng)，培養(yǎng)終濃度為（0ug/ml、1ug/ml、2ug/ml、4ug/ml），PHA為陽性對照，并分別于培養(yǎng)后（0h、24h、48h、72h）時間點收集上清液及培養(yǎng)細胞。采用流式細胞術(shù)檢測分析培養(yǎng)細胞中CD4+CD25+FoxP3+細胞的量，以及RT-PCR檢測分析FoxP3的mRNA水平。
　　結(jié)果：①受ESAT6、Ag85B刺激培養(yǎng)后，CD4+CD25+Fox

18、P3+細胞的量及FOXP3mRNA水平均能明顯升高，健康者與潛伏感染者CD4+CD25+FoxP3+細胞的量及FOXP3mRNA水平均明顯高于BCG的刺激；②受ESAT6、Ag85B刺激培養(yǎng)后，耐藥性結(jié)核病患者與潛伏感染者CD4+CD25+FoxP3+細胞增加的量明顯高于健康者；但隱性感染者FOXP3mRNA增加的量卻明顯高于耐藥性結(jié)核病患者。③ESAT-6、Ag85B濃度增加，CD4+CD25+FoxP3+細胞量與FOXP3mRNA表

19、達呈上升趨勢；在有效培養(yǎng)時間內(nèi)，72h時間點，CD4+CD25+FoxP3+細胞量與FOXP3mRNA表達最高。
　　結(jié)論：①結(jié)核分枝桿菌能通過特異性分泌蛋白ESAT-6、Ag85B誘導刺激CD4+CD25+FoxP3+細胞增殖及FOXP3mRNA轉(zhuǎn)錄，且其量可能與其濃度存在正相關(guān)，從側(cè)面證實了結(jié)核病患者外周血CD4+CD25+FoxP3+細胞量增高程度與機體結(jié)核分枝菌載量有關(guān)。②潛伏感染者FOXP3mRNA更容易受ESAT-6、