BCG與嵌合ESAT-6重組鞭毛蛋白的聯(lián)合黏膜免疫及其特性分析.pdf

1、結核病(tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)復合物引起的一種慢性傳染病，目前全球有1/3人口感染了M.tb，每年大約有300萬人死于結核病，且大部分是在發(fā)展中國家。接種疫苗被認為是控制結核病的手段之一，當前使用的卡介苗(Bacille Calmette and Guérin，BCG)能夠有效預防兒童和新生兒患病，但是對成年人活動性結核病保護效果有限。因此，迫切

2、需要研制一種新型有效的疫苗或對現(xiàn)有疫苗進行改良。
　　 M.tb一些分泌抗原的保護性作用已經得到確認，在這些分泌蛋白中，6 kD早期分泌靶抗原(6-kDa early secreted antigenic target，ESAT-6)的作用相當重要。ESAT-6存在于許多致病性分枝桿菌中，但是在BCG和大部分環(huán)境分枝桿菌中缺失。它作為一種T細胞抗原，能夠有效激發(fā)細胞免疫應答，被建議作為診斷試劑用于區(qū)分M.tb感染和先前的BCG接

3、種。因此，在本研究中，以沙門菌鞭毛蛋白為載體嵌合運送ESAT-6蛋白，并將其與BCG聯(lián)合應用，以黏膜滴鼻方式免疫小鼠，探討誘導的免疫應答特性。
　　 1.BCG與大腸桿菌表達fliC/esat蛋白聯(lián)合應用的黏膜免疫應答規(guī)律研究
　　 從大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達并純化fliC/esat蛋白，Western-blotting分析其與野生型鼠傷寒沙門菌血清或ESAT-6單抗(Ms mAb to ESAT-6)作用后情況，結果都出

4、現(xiàn)了特異性的目的條帶。制備小鼠的骨髓樹突狀細胞(bone marrow dendritic cells，BMDC)，培養(yǎng)至第6天時用fliC/esat蛋白刺激，24 h后收集細胞分別標記CD11c-FITC及CD80-Biotin、CD86-Biotin、MHC-Ⅰ-Biotin、MHC-Ⅱ-Biotin，F(xiàn)ACS檢測各分子的表達情況，發(fā)現(xiàn)fliC/esat蛋白能夠誘導BMDC的成熟，不同程度的上調共刺激分子CD80、CD86、MHC-

5、Ⅰ、MHC-Ⅱ的表達水平。通過滴鼻免疫途徑，將BCG與fliC/esat蛋白聯(lián)合免疫C57BL/6(H-2b)小鼠，結果顯示，血清和支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BAF)中IgA抗體水平顯著高于單獨免疫BCG或fliC/esat蛋白時抗體水平，說明能夠誘導產生一定水平的黏膜抗體；運用淋巴細胞增殖試驗、ELISPOT、夾心ELISA等免疫學方法檢測脾臟淋巴細胞免疫應答情況后顯示，細胞經純化的結

6、核桿菌素(PPD)和ESAT-6(1-20aa)多肽刺激后能夠明顯增殖，產生IFN-γ的分泌細胞數(shù)顯著上升并與產生IL-4的分泌細胞在數(shù)量上差異顯著，誘導以Th-1為主的免疫應答，且免疫應答水平要高于單獨免疫BCG或fliC/esat蛋白組。動態(tài)實驗持續(xù)觀察BCG與fliC/esat蛋白聯(lián)合免疫小鼠后2-14周的免疫應答變化情況，發(fā)現(xiàn)IgA抗體水平、早期活化分子CD69的表達、淋巴細胞增殖及細胞因子的分泌都能持續(xù)到8-10周后才呈現(xiàn)下降

7、趨勢。因此，BCG與fliC/esat蛋白聯(lián)合免疫的策略在小鼠模型上能夠誘導更強和更持久的黏膜免疫應答和細胞免疫應答，可為結核病的預防提供新的途徑和方法。
　　 2.BCG與沙門菌重組鞭毛蛋白聯(lián)合黏膜免疫誘導的免疫應答研究
　　 用P22噬菌體介導LB5000(fliC/esat)向都柏林沙門菌SL5928轉導，利用PCR、動力學檢測及血清凝集實驗鑒定并獲得轉導菌SL5928(fliC/esat)。提取轉導沙門菌SL59

8、28(fliC/esat)鞭毛蛋白，Western-blotting顯示其與野生型鼠傷寒沙門菌血清或ESAT-6單抗(Ms mAb to ESAT-6)作用后都能出現(xiàn)特異性的目的條帶。制備小鼠的BMDC，培養(yǎng)至第6天時用SL5928(fliC/esat)鞭毛蛋白刺激，6 h后收集BMDC，利用RT-PCR技術檢測Toll樣受體5(TLR-5)的表達，結果能夠表達TLR-5 mRNA，而對照組(未刺激)未見表達。將SL5928(fliC/

9、esat)鞭毛蛋白與BCG通過滴鼻免疫途徑聯(lián)合免疫C57BL/6(H-2b)小鼠，檢測結果顯示，血清和BAF中IgA抗體水平顯著高于單獨免疫BCG或SL5928(fliC/esat)鞭毛蛋白時水平，說明能夠產生一定水平的黏膜抗體；CD4+、CD8+T細胞表面分子CD69表達提高，T細胞得到活化；運用淋巴細胞增殖試驗、夾心ELISA等免疫學方法檢測淋巴細胞免疫應答情況后顯示，脾臟淋巴細胞經PPD或ESAT-6(1-20aa)多肽刺激后能夠