BCG與嵌合ESAT-6重組鞭毛蛋白的聯(lián)合黏膜免疫及其特性分析.pdf

1、結(jié)核病(tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)復(fù)合物引起的一種慢性傳染病，目前全球有1/3人口感染了M.tb，每年大約有300萬人死于結(jié)核病，且大部分是在發(fā)展中國家。接種疫苗被認(rèn)為是控制結(jié)核病的手段之一，當(dāng)前使用的卡介苗(Bacille Calmette and Guérin，BCG)能夠有效預(yù)防兒童和新生兒患病，但是對成年人活動性結(jié)核病保護(hù)效果有限。因此，迫切

2、需要研制一種新型有效的疫苗或?qū)ΜF(xiàn)有疫苗進(jìn)行改良。
　　 M.tb一些分泌抗原的保護(hù)性作用已經(jīng)得到確認(rèn)，在這些分泌蛋白中，6 kD早期分泌靶抗原(6-kDa early secreted antigenic target，ESAT-6)的作用相當(dāng)重要。ESAT-6存在于許多致病性分枝桿菌中，但是在BCG和大部分環(huán)境分枝桿菌中缺失。它作為一種T細(xì)胞抗原，能夠有效激發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答，被建議作為診斷試劑用于區(qū)分M.tb感染和先前的BCG接

3、種。因此，在本研究中，以沙門菌鞭毛蛋白為載體嵌合運(yùn)送ESAT-6蛋白，并將其與BCG聯(lián)合應(yīng)用，以黏膜滴鼻方式免疫小鼠，探討誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答特性。
　　 1.BCG與大腸桿菌表達(dá)fliC/esat蛋白聯(lián)合應(yīng)用的黏膜免疫應(yīng)答規(guī)律研究
　　 從大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并純化fliC/esat蛋白，Western-blotting分析其與野生型鼠傷寒沙門菌血清或ESAT-6單抗(Ms mAb to ESAT-6)作用后情況，結(jié)果都出

4、現(xiàn)了特異性的目的條帶。制備小鼠的骨髓樹突狀細(xì)胞(bone marrow dendritic cells，BMDC)，培養(yǎng)至第6天時用fliC/esat蛋白刺激，24 h后收集細(xì)胞分別標(biāo)記CD11c-FITC及CD80-Biotin、CD86-Biotin、MHC-Ⅰ-Biotin、MHC-Ⅱ-Biotin，F(xiàn)ACS檢測各分子的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)fliC/esat蛋白能夠誘導(dǎo)BMDC的成熟，不同程度的上調(diào)共刺激分子CD80、CD86、MHC-

5、Ⅰ、MHC-Ⅱ的表達(dá)水平。通過滴鼻免疫途徑，將BCG與fliC/esat蛋白聯(lián)合免疫C57BL/6(H-2b)小鼠，結(jié)果顯示，血清和支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BAF)中IgA抗體水平顯著高于單獨免疫BCG或fliC/esat蛋白時抗體水平，說明能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生一定水平的黏膜抗體；運(yùn)用淋巴細(xì)胞增殖試驗、ELISPOT、夾心ELISA等免疫學(xué)方法檢測脾臟淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答情況后顯示，細(xì)胞經(jīng)純化的結(jié)

6、核桿菌素(PPD)和ESAT-6(1-20aa)多肽刺激后能夠明顯增殖，產(chǎn)生IFN-γ的分泌細(xì)胞數(shù)顯著上升并與產(chǎn)生IL-4的分泌細(xì)胞在數(shù)量上差異顯著，誘導(dǎo)以Th-1為主的免疫應(yīng)答，且免疫應(yīng)答水平要高于單獨免疫BCG或fliC/esat蛋白組。動態(tài)實驗持續(xù)觀察BCG與fliC/esat蛋白聯(lián)合免疫小鼠后2-14周的免疫應(yīng)答變化情況，發(fā)現(xiàn)IgA抗體水平、早期活化分子CD69的表達(dá)、淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的分泌都能持續(xù)到8-10周后才呈現(xiàn)下降

7、趨勢。因此，BCG與fliC/esat蛋白聯(lián)合免疫的策略在小鼠模型上能夠誘導(dǎo)更強(qiáng)和更持久的黏膜免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，可為結(jié)核病的預(yù)防提供新的途徑和方法。
　　 2.BCG與沙門菌重組鞭毛蛋白聯(lián)合黏膜免疫誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答研究
　　 用P22噬菌體介導(dǎo)LB5000(fliC/esat)向都柏林沙門菌SL5928轉(zhuǎn)導(dǎo)，利用PCR、動力學(xué)檢測及血清凝集實驗鑒定并獲得轉(zhuǎn)導(dǎo)菌SL5928(fliC/esat)。提取轉(zhuǎn)導(dǎo)沙門菌SL59

8、28(fliC/esat)鞭毛蛋白，Western-blotting顯示其與野生型鼠傷寒沙門菌血清或ESAT-6單抗(Ms mAb to ESAT-6)作用后都能出現(xiàn)特異性的目的條帶。制備小鼠的BMDC，培養(yǎng)至第6天時用SL5928(fliC/esat)鞭毛蛋白刺激，6 h后收集BMDC，利用RT-PCR技術(shù)檢測Toll樣受體5(TLR-5)的表達(dá)，結(jié)果能夠表達(dá)TLR-5 mRNA，而對照組(未刺激)未見表達(dá)。將SL5928(fliC/

9、esat)鞭毛蛋白與BCG通過滴鼻免疫途徑聯(lián)合免疫C57BL/6(H-2b)小鼠，檢測結(jié)果顯示，血清和BAF中IgA抗體水平顯著高于單獨免疫BCG或SL5928(fliC/esat)鞭毛蛋白時水平，說明能夠產(chǎn)生一定水平的黏膜抗體；CD4+、CD8+T細(xì)胞表面分子CD69表達(dá)提高，T細(xì)胞得到活化；運(yùn)用淋巴細(xì)胞增殖試驗、夾心ELISA等免疫學(xué)方法檢測淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答情況后顯示，脾臟淋巴細(xì)胞經(jīng)PPD或ESAT-6(1-20aa)多肽刺激后能夠