鞭毛蛋白在松萎蔫病中的作用機(jī)理研究.pdf

1、為了研究鞭毛蛋白在松萎蔫病中的具體作用,本文首先對松材線蟲攜帶的熒光假單胞菌(PseudomonasfluorescensGcM5-1A)分泌的鞭毛蛋白對黑松愈傷組織細(xì)胞的致死方式進(jìn)行研究。結(jié)果表明,經(jīng)過鞭毛蛋白處理的黑松愈傷組織細(xì)胞細(xì)胞核解體、基因組DNA發(fā)生降解,但無明顯的梯形條帶形成,因此推測鞭毛蛋白對黑松細(xì)胞的處死方式為非典型性細(xì)胞凋亡。其次,本文還研究了鞭毛蛋白誘導(dǎo)的黑松細(xì)胞死亡對松材線蟲及其攜帶的熒光假單胞菌GcM5-1A的

2、繁殖影響,結(jié)果表明,鞭毛蛋白預(yù)處理黑松愈傷組織細(xì)胞再接種松材線蟲較正常的愈傷組織細(xì)胞能促進(jìn)松材線蟲的繁殖,且在0～9d范圍內(nèi),處理時間越長則松材線蟲的繁殖速度越快;同時,鞭毛蛋白預(yù)處理的黑松愈傷組織細(xì)胞較正常的愈傷組織對松材線蟲攜帶熒光假單胞菌的繁殖也有一定的促進(jìn)作用,用加熱致死黑松愈傷組織分別接種松材線蟲及其攜帶的熒光假單胞菌獲得了相似的結(jié)果;將松材線蟲直接接種于鞭毛蛋白溶液并培養(yǎng)5d,結(jié)果發(fā)現(xiàn)接入松材線蟲的鞭毛蛋白較對照組明顯減少,

3、條帶無降解的現(xiàn)象,并且松材線蟲的數(shù)量有明顯的增加,推測可能是松材線蟲因攝食了鞭毛蛋白而促進(jìn)其繁殖。上述研究表明,鞭毛蛋白不僅通過誘導(dǎo)黑松細(xì)胞的死亡對松材線蟲及其攜帶致病熒光假單胞菌的繁殖具有一定的促進(jìn)作用,而且鞭毛蛋白本身可以提供松材線蟲繁殖的營養(yǎng)而促進(jìn)松材線蟲的繁殖,這為松萎蔫病的松材線蟲與細(xì)菌復(fù)合致病學(xué)說提供了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　 為了進(jìn)一步研究鞭毛蛋白的作用機(jī)理,本文還開展了熒光假單胞菌GcM5-1A(P.fluore

4、scensGcM5-1A)鞭毛蛋白基因的克隆與重組表達(dá)的研究,結(jié)果表明,熒光假單胞菌GeM5-1A鞭毛蛋白基因的開放讀框全長1659bp,共編碼552氨基酸殘基。熒光假單胞菌GeM5-1A(P.fluorescensGcM5-1A)鞭毛蛋白基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后克隆到表達(dá)載體pET-15b上,構(gòu)建表達(dá)載體pET-15b-fla。將pET-15b-fla轉(zhuǎn)化EcoliBL21(DE3)構(gòu)建工程菌,IPTG誘導(dǎo)重組鞭毛蛋白在工程菌中的高效表達(dá),