鼠傷寒沙門(mén)氏菌鞭毛蛋白增強(qiáng)抗體應(yīng)答的研究.pdf

1、一、研究背景
　　 鼠傷寒沙門(mén)氏菌是周毛菌，菌體周身遍布鞭毛，鞭毛是由基礎(chǔ)小體、鉤狀體和絲狀體三部分構(gòu)成，它不僅是沙門(mén)氏菌的運(yùn)動(dòng)器官，而且同時(shí)還具有特殊的抗原性，稱為H抗原，H抗原是沙門(mén)氏菌鑒定分型的重要依據(jù)，而且可以激發(fā)先天性免疫系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)答。隨著對(duì)鞭毛主要成份——鞭毛蛋白免疫作用機(jī)理的不斷深入研究，逐漸發(fā)現(xiàn)沙門(mén)氏菌鞭毛蛋白可以通過(guò)自身激發(fā)先天性免疫系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)答，以啟動(dòng)、增強(qiáng)特異性免疫系統(tǒng)對(duì)其他與鞭毛蛋白相連接的抗原產(chǎn)生特異性

2、的應(yīng)答，發(fā)揮較強(qiáng)的免疫佐劑作用，而且可以在粘膜表面誘導(dǎo)以Th2 型免疫反應(yīng)并且伴有IgA的分泌。其強(qiáng)大的免疫佐劑功效隨后在多種病原體疫苗的研究中獲得應(yīng)用，如應(yīng)用于鼠疫桿菌、變異鏈球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、甲型流感病毒、西尼羅河病毒、和間日瘧原蟲(chóng)等多種病原體的表位多肽和抗原蛋白，甚至用于增強(qiáng)甲型H1N1流感病毒滅活株的免疫應(yīng)答。而且在各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)各種疫苗制劑因加入沙門(mén)氏菌鞭毛蛋白引起的過(guò)敏反應(yīng)或其他不良反應(yīng)，因此鞭毛蛋白作為疫苗

3、佐劑是較為安全的。先天性免疫不僅僅是抵抗病原體侵襲的第一道屏障，而且在識(shí)別和區(qū)分病原體、啟動(dòng)獲得性免疫中起了關(guān)鍵的作用，抗原遞呈細(xì)胞尤其是樹(shù)突狀細(xì)胞在其中擔(dān)負(fù)了非常重要的角色。抗原遞呈細(xì)胞具有所謂的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR），可以識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）。鞭毛蛋白是一種蛋白性的PAMP，可以被PRR

4、 主要是細(xì)胞表面Toll 樣受體5（Toll-likereceptor 5，TLR5）識(shí)別和區(qū)分，兩者特異性結(jié)合后鞭毛蛋白即可作用于表達(dá)有TLR5的細(xì)胞，如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞等，通過(guò)激活TLR5，活化MyD88 依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控TNF-α、IL-6和IL-12等促炎細(xì)胞因子的合成，上調(diào)協(xié)同刺激分子CD80、CD86 以及MHCⅡ分子，從而使這些主要的抗原遞呈細(xì)胞激活和成熟，攝取抗

5、原能力增強(qiáng)，向引流淋巴結(jié)遷移能力增強(qiáng)，從而招引、激活和分化T 輔助細(xì)胞，最終啟動(dòng)獲得性免疫應(yīng)答，實(shí)現(xiàn)免疫佐劑功效。而對(duì)于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)部的鞭毛蛋白則主要依賴表達(dá)在細(xì)胞胞質(zhì)中的NOD 樣受體(Nucleotide oligomerization domain (NOD)-like receptor, NLR）家族中的IPAF（IL-1β-converting enzyme (ICE) protease activating factor）和N

6、AIP5（neuronAlapoptosisinhibitory protein 5）受體，其中IPAF 受體起主要的識(shí)別作用，而NAIP5 則可與IPAF聯(lián)合作用，起到增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)胞質(zhì)內(nèi)鞭毛蛋白的識(shí)別作用。
　　 目前許多疾病的疫苗候選抗原都面臨在人體內(nèi)低免疫原性的問(wèn)題，例如惡性瘧原蟲(chóng)裂殖子頂端膜抗原1(apicAlmembrane antigen 1,AMA-1)蛋白，臨床試驗(yàn)表明使用鋁佐劑或Montanide ISA720佐

7、劑都不能使AMA1在絕大多數(shù)受試者中激發(fā)出有效水平的抗體滴度，當(dāng)在鋁佐劑中添加了Toll 樣受體9（TLR9）的激動(dòng)劑CpG ODN后，在受試者中抗AMA1的抗體水平得到了極大提高，并且高滴度的免疫血清在瘧原蟲(chóng)體外抑制試驗(yàn)中的抑制率可達(dá)到90％以上，最高者達(dá)到96％。然而，由于在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)1例由CpG ODN 產(chǎn)生的副反應(yīng)，所以CpG ODN的安全性已成為這種AMA1疫苗制劑在臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步推進(jìn)的重要障礙。
　　 本研究工

8、作將以作為T(mén)LR5 激動(dòng)劑的純化沙門(mén)氏菌鞭毛蛋白（flagella filamentprotein，F(xiàn)liC）替代作為T(mén)LR9 激動(dòng)劑的CpG ODN1826，加入到模型抗原——卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）和氫氧化鋁佐劑的疫苗制劑中，免疫實(shí)驗(yàn)小鼠，觀察和比較添加鞭毛蛋白的疫苗制劑所激發(fā)的免疫應(yīng)答，為鞭毛蛋白作為佐劑增強(qiáng)劑應(yīng)用于以各種低免疫原性候選抗原的疫苗提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 二、研究目的
　　 本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)大

9、樣本隨機(jī)對(duì)照的研究方法，在BALB/c小鼠中，研究鼠傷寒沙門(mén)氏菌鞭毛蛋白增強(qiáng)抗原特異性抗體應(yīng)答的佐劑增強(qiáng)劑功效及其機(jī)制，同時(shí)與CpGODN 進(jìn)行比較，觀察兩者佐劑增強(qiáng)劑功效的差別，以及采用不同免疫方式對(duì)鞭毛蛋白作為佐劑增強(qiáng)劑的影響。
　　 三、研究方法
　　 1、采用酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）測(cè)定血漿中特異性抗OVA的IgG抗體滴度，以及各種IgG分型

10、抗體（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3）的滴度。
　　 2、采用ELISA 法測(cè)定小鼠脾細(xì)胞體外刺激上清中干擾素gamma（Interferon γ，IFN-γ）和白介素4（Interleukin-4，IL-4）的含量。3、采用TurboFect 體外轉(zhuǎn)染試劑構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)pUNO-hTLR5 質(zhì)粒的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株。
　　 四、研究結(jié)果
　　 1、采用肌肉注射免疫方式聯(lián)合應(yīng)用鞭毛蛋

11、白的卵清蛋白/ 氫氧化鋁佐劑（OVA+Alhydrogel+Flagellin）組誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗OVA抗體滴度顯著高于OVA+Alhydrogel組，低于聯(lián)合應(yīng)用CpG ODN組，但隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)，聯(lián)合應(yīng)用鞭毛蛋白組特異性抗體滴度逐漸高于聯(lián)合應(yīng)用CpG ODN組。整個(gè)免疫過(guò)程中，鞭毛蛋白顯示出與CpG ODN 相當(dāng)?shù)拿庖咦魟┕πА?br>　　 2、肌肉免疫方式中添加鞭毛蛋白組特異性抗體亞型中IgG2a和IgG2b 比例較單純鋁佐

12、劑組升高。體外刺激添加鞭毛蛋白組小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)基上清中檢測(cè)到較單純鋁佐劑組高水平的IFN-γ和低水平的IL-4，考慮由鼠沙門(mén)氏菌鞭毛蛋白誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是Th1/Th2 混合型，但以Th1型為主，且可通過(guò)經(jīng)典途徑活化補(bǔ)體系統(tǒng)，全面提高機(jī)體對(duì)外源性抗原的特異性體液免疫反應(yīng)及細(xì)胞免疫反應(yīng)。3、采用皮下注射免疫和腹腔注射免疫方式，整個(gè)免疫過(guò)程中添加鞭毛蛋白或者CpGODN組特異性抗體滴度都顯著高于單純應(yīng)用鋁佐劑組，且添加CpG ODN組升高更

13、為明顯。
　　 4、皮下注射免疫和腹腔注射免疫方式中鞭毛蛋白誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答機(jī)制與肌肉免疫方式中一致，只是采用皮下免疫后特異性抗體IgG2b 比例未見(jiàn)明顯升高，考慮此種免疫方式下鞭毛蛋白不能有效活化補(bǔ)體系統(tǒng)。
　　 5、成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)pUNO-hTLR5 質(zhì)粒的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。
　　 五、研究結(jié)論
　　 本研究首次采用鋁佐劑的吸附作用，選取新型免疫佐劑鞭毛蛋白，體外將鼠傷寒沙