多重耐藥泵及其調控蛋白在鼠傷寒沙門氏菌對氟喹諾酮類耐藥中的作用.pdf

1、鼠傷寒沙門氏菌是一類主要食源性病原菌，氟喹諾酮類是治療該菌感染的首選藥物。在該類藥物選擇壓力下，細菌產生耐藥。目前，喹諾酮耐藥決定區(qū)靶位點突變和活性多重耐藥泵是鼠傷寒沙門氏菌對氟喹諾酮類主要耐藥機制。其中，喹諾酮耐藥決定區(qū)GyrA內單個靶位點突變僅使細菌對氟喹諾酮類敏感性降低，而不導致其對該類藥物耐藥。然而，多數臨床分離在GyrA內攜帶單個靶位點突變的鼠傷寒沙門氏菌卻表現對氟喹諾酮類耐藥，所以活性多重耐藥泵在鼠傷寒沙門氏菌對氟喹諾酮類耐

2、藥過程中具有重要作用。
　　 鼠傷寒沙門氏菌細胞膜中AcrAB-TolC是最重要的一個多重耐藥泵，它可阻止藥物進入到細胞內，但該泵蛋白在細胞質間隙或細胞內膜外層俘獲藥物，同時在敏感菌中僅過表達該多重耐藥泵也不導致細菌對喹諾酮類耐藥，故其它家族多重耐藥泵必然參與細菌耐藥過程。在多重耐藥泵表達過程中，多個調控蛋白可能參與其表達調節(jié)，然而哪個調控蛋白是外排氟喹諾酮類多重耐藥泵主要調控蛋白？該蛋白對氟喹諾酮類耐藥突變株產生具有何種影響？

3、本實驗用環(huán)丙沙星體外誘導敏感鼠傷寒沙門氏菌，獲得系列多重耐藥自發(fā)突變株，隨后在所選自發(fā)突變株中確定外排氟喹諾酮類多重耐藥泵及其主要調控蛋白，最后研究主要調控蛋白對敏感菌及其首次耐藥突變株突變抑制濃度影響。該研究是鼠傷寒沙門氏菌對氟喹諾酮類多重耐藥理論的一次有益補充，也將為臨床多重耐藥鼠傷寒沙門氏菌防治提供新的理論基礎。
　　 鼠傷寒沙門氏菌CVCC541(ST)在含有不同濃度環(huán)丙沙星MH平板上逐步篩選，獲得對環(huán)丙沙星敏感性降低并

4、表現多重耐藥的系列誘導菌。所選誘導菌經PCR擴增、測序，檢測其喹諾酮耐藥決定區(qū)(Quinolone Resistant Determine Regios，QRDRs)內靶位點突變。隨后，通過檢測多重耐藥泵抑制劑(CCCP或PAβN)對部份誘導菌細胞內環(huán)丙沙星和諾氟沙星蓄積濃度變化，初步闡明所選誘導菌中外排氟喹諾酮類多重耐藥泵。對所選誘導菌提取總RNA并反轉錄，以體外合成cDNA為模板，檢測誘導菌細胞內外排氟喹諾酮類多重耐藥泵相對表達水平

5、。
　　 在ST中，按照PCR產物一步失活染色體基因方法，逐個失活多重耐藥泵調控蛋白(RamA和MarA)。然后，利用噬菌體將失活基因逐個傳導至誘導菌中，對調控蛋白失活后ST及其誘導菌檢測不同藥物敏感性。另外，在RamA失活菌中互補RamA，同時檢測多重耐藥泵表達水平。檢測誘導菌中，活性多重耐藥泵啟動子區(qū)和主要調控蛋白(RamRA，MarRAB，SoxRS，AcrR)基因序列并對發(fā)生突變的調控蛋白在誘導菌中互補，闡明誘導菌中多重

6、耐藥泵主要調控蛋白表達的分子機制。
　　 檢測ST和SR(STramA：：aph)菌生長速度，體外篩選ST和SR環(huán)丙沙星首次耐藥突變株，隨后檢測其喹諾酮耐藥決定區(qū)內GyrA靶位點突變。在SR突變株SR4-3(Ser83→Phe)或SR1-9(Asp87→Tyr)中過表達RamA。測定ST、ST8-1(Ser83→Phe)、ST2-6(Asp87→Tyr)、SR、SR4-3、SR1-9及其RamA過表達菌對環(huán)丙沙星和恩諾沙星突變抑

7、制濃度，同時檢測各菌對環(huán)丙沙星突變抑制率。
　　 在環(huán)丙沙星選擇壓力下，獲得7個對環(huán)丙沙星敏感性逐步降低的誘導菌(SI1-SI7)。其中，SI2(CIP：MIC0.1 mg/l)在QRQRs區(qū)內沒有任何靶位點突變，但表現對所測藥物敏感性下降；SI6(CIP：MIC16 mg/l)在GyrA中攜帶Ser83→Phe突變，但表現多重耐藥，同時四環(huán)素、氯酶素和氟苯尼考MIC值與SI7相比沒有繼續(xù)上升。SI2和SI6中環(huán)丙沙星和諾氟沙星

8、蓄積濃度均低于ST菌。當加入CCCP后，SI2中環(huán)丙沙星蓄積濃度增加但仍低于無抑制劑存在時ST菌藥物蓄積濃度；當加入PApN后，環(huán)丙沙星在SI2中蓄積濃度顯著上升與ST菌藥物蓄積濃度相似：在SI6中，加入CCCP后，環(huán)丙沙星蓄積濃度與ST菌藥物蓄積濃度相似；然而加入PAβN后，環(huán)丙沙星蓄積濃度低于ST菌。另外，SI2和SI6在耐藥泵抑制劑存在下，諾氟沙星蓄積濃度變化與環(huán)丙沙星蓄積濃度變化趨勢相似。Real time RT-PCR結果表明

9、，SI6中僅檢測到AcrAB和MdtK表達且其表達量相對ST分別增加30.1和8.15倍；另外，SI2中AcrAB和MdtK表達量相對ST增加6.08和3.87倍。
　　 當調控蛋白RamA在ST(CIP：MIC0.0125 mg/l)中失活后，SR菌對所測藥物敏感性相對ST沒有顯著改變。當RamA在SI2中失活后，SI2R對所測藥物除萘啶酸外下降2-8倍，其中S12R對環(huán)丙沙星、沙拉沙星、恩諾沙星和萘啶酸MIC值與SR菌所測值

10、相同：當RamA在SR中過表達后，STRA對所測藥物MIC值相對SR菌上升2-6倍，其中STRA對氧氟沙星和四環(huán)素MIC值與SI2菌所測值相同，對環(huán)丙沙星、諾氟沙星和恩諾沙星MIC值是SI2菌所測值0.5倍。另外，STRA中AcrAB表達水平與S16中相似，MdtK表達水平與SI2中相似。所以，RamA是SI2中主要調控蛋白，它通過激活MdtK和增加AcrAB表達水平，使細菌對多個藥物敏感性下降。
　　 在SI6(CIP：MIC

11、16 mg/l)中，RamA失活后，SI6R(CIP：MIC2 mg/l)對所測藥物除萘啶酸外MIC值下降2-8倍，但SI6R仍對所測氟喹諾酮類耐藥。當RamA在SI3R中過表達后，SI3RA對環(huán)丙沙星、諾氟沙星、四環(huán)素和氯霉素MIC值增加2-16倍；對氧氟沙星、沙拉沙星和氟苯尼考敏感性保持穩(wěn)定；對恩諾沙星、萘啶酸和紅霉素MIC值反而下降。盡管SI3RA和SI6R攜帶有相同GyrA靶位點突變，SI3RA對喹諾酮類MIC值均低于SI6R所

12、測值。另外，SI6R對四環(huán)素MIC值與ST相同；SI3RA對氯霉素MIC值與SI6相同；AcrAB表達水平在STRA和SI6中相似。所以，RamA主要控制AcrAB表達水平，AcrAB和其它多重耐藥泵協(xié)同作用導致SI6對氟喹諾酮類耐藥。
　　 SI2和SI6僅在ramR序列中發(fā)現突變。當RamR在SI2中互補后，SI2RR對氟喹諾酮類MIC值下降2-4倍，但未回復到ST敏感水平。另外，當調控蛋白MarA在ST、SI2和SI6中失

13、活后，細菌對所測藥物敏感性均沒有明顯改變。
　　 在對數生長期，SR(STramA：：aph)菌生長速度快于ST菌。在不同環(huán)丙沙星濃度選擇下，RamA缺失降低攜帶GyrA靶位點突變株篩選幾率。RamA過表達導致SR首次耐突變株SR4-3和SR1-9對環(huán)丙沙星MPC值增加，對恩諾沙星MPC值下降。SR4-3和SR1-9對環(huán)丙沙星MPC值、突變選擇框均低于分別攜帶相同靶點突變的ST首次耐突變株ST8-1和ST2-6。在相同濃度環(huán)丙沙

14、星作用下，RamA過表達菌83RA和87RA擁有最大耐藥突變率；SR4-3和SR1-9耐藥突變率分別低與ST8-1和ST2-6。所以，RamA表達是細菌對環(huán)丙沙星產生耐藥的一個主要原因，抑制RamA表達能夠減少耐藥菌出現。
　　 總之，本研究首次證實：
　　 (1)多重耐藥泵MdtK參與了鼠傷寒沙門氏菌對環(huán)丙沙星耐藥過程，它與AcrAB協(xié)同作用促進細菌多重耐藥突變株產生。多重耐藥泵調控蛋白RamA可激活mdtK表達，但不

15、能導致其高水平表達。
　　 (2)在環(huán)丙沙星選擇壓力下，敏感鼠傷寒沙門氏菌中多重耐藥泵主要調控蛋白RamA的抑制蛋白RamR，由于底物結合區(qū)氨基酸缺失導致其從ramA啟動子區(qū)解離，進而啟動ramA表達。
　　 (3)RamA是一個主要多重耐藥泵調控蛋白，其表達促進了環(huán)丙沙星耐藥突變株蓄積、增值，抑制RamA表達水平可減低環(huán)丙沙星耐藥突變株出現。
　　 本研究以上發(fā)現豐富了鼠傷寒沙門氏菌的多重耐藥理論，同時預示Ra