鼠傷寒沙門氏菌外排泵AcrAB失活對(duì)其它外排泵表達(dá)的影響.pdf

1、沙門氏菌是一類主要食源性病原菌，在沙門氏菌誘發(fā)感染病例中,鼠傷寒沙門氏菌占很高的分離率。氟喹諾酮類藥作為治療沙門氏菌病的首選藥物被廣泛用于臨床。在氟喹諾酮類選擇壓力下，鼠傷寒沙門氏菌很快對(duì)其產(chǎn)生耐藥，其中最主要的耐藥機(jī)制是增強(qiáng)的外排作用和拓?fù)洚悩?gòu)酶突變。
　　本實(shí)驗(yàn)選取敏感的鼠傷寒沙門氏菌臨床株 SH10作為親本菌，建立了pKD46和噬菌體 P22介導(dǎo)的基因敲除的方法。為研究 AcrAB-TolC及其調(diào)控因子對(duì) SH10敏感性的作

2、用，我們分別構(gòu)建了外排泵和調(diào)控因子的基因缺失株并采用二倍瓊脂稀釋法測(cè)定了缺失株的MIC。結(jié)果顯示，與原菌 SH10相比，這些缺失株對(duì)受試的15種抗生素的MIC值沒(méi)有發(fā)生明顯的變化，表明缺失acrAB及其調(diào)控因子沒(méi)有對(duì) SH10的藥物敏感性產(chǎn)生顯著的影響。另外，我們?cè)诎牍腆w培養(yǎng)基上測(cè)定了這些缺失株的遷移力。數(shù)據(jù)顯示，缺失 marA、ramA和 soxR后，細(xì)菌在培養(yǎng)基上移動(dòng)的半徑由27 mm下降至18.3-21.7 mm（P<0.05或P

3、<0.01）；而缺失 marR、ramR和 soxS時(shí)，細(xì)菌的移動(dòng)半徑由27 mm升高至31-33.7 mm（P<0.05)。缺失acrA或acrB時(shí)，細(xì)菌的移動(dòng)半徑也增大，但變化不顯著；而缺失 tolC時(shí)，細(xì)菌的移動(dòng)半徑減小。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子marA、ramA和soxR對(duì)鼠傷寒沙門氏菌SH10的遷移力起著正向調(diào)控的作用。
　　為研究鼠傷寒沙門氏菌耐多藥外排泵 AcrAB-TolC是否存在反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，我們檢測(cè)了 SH1

4、0在加入外排泵抑制劑 PAβN后 acrAB-tolC各基因的表達(dá)情況，以及缺失 acrA或 acrB后剩余外排泵基因和調(diào)控因子的表達(dá)水平。熒光定量數(shù)據(jù)顯示，加入 PAβN后，acrA和 acrB的表達(dá)水平升高到原來(lái)的2.32倍和1.57倍，marA和 ramA的表達(dá)水平分別提高到原來(lái)的1.40倍和2.94倍。當(dāng)缺失acrA時(shí)，acrB和 tolC的表達(dá)水平升高到原來(lái)的2.92倍和2.48倍，而 marA和ramA則分別升高到原來(lái)的2.

5、29倍和2.89倍。當(dāng)缺失tolC時(shí)，acrA和acrB的表達(dá)升高了2.48倍和2.45倍，marA和ramA分別升高了3.03倍和3.07倍。因此，當(dāng)沙門氏菌外排泵 AcrAB-TolC功能失活時(shí)，細(xì)菌會(huì)通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因ramA和marA反過(guò)來(lái)促進(jìn)acrAB-tolC的表達(dá)。
　　為研究鼠傷寒沙門氏菌 SH10主要外排泵 acrAB與其余外排泵間的關(guān)系，我們量測(cè)定了?acrAB::kan缺失株中另外八種外排泵基因 acrF、

6、acrD、mdsB、mdtB、macA、emrA、mdfA和 mdtK的表達(dá)水平。除 mdtK外，其余的外排泵的表達(dá)水平均不同程度上調(diào)（1.59-2.26倍，P<0.05）。同樣地，我們還檢測(cè)了通過(guò)P22構(gòu)建的?acrABmarA::kan、?acrABramA::kan和?acrABsoxS::kan雙基因缺失株中另外八種外排泵的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，缺失?acrAB::kan中的調(diào)控基因marA、ramA和 soxS，可使缺失株中其它

7、外排泵的表達(dá)水平顯著地降低（0.26-0.85倍、0.18-0.88倍和0.27-1.26倍，P<0.05）。另外，我們也檢測(cè)了?acrEF::kan、?acrD::kan、?mdtABC::kan、?mdsABC::kan、?macAB::kan、?emrAB::kan、?mdfA::kan和?mdtK::kan中 acrAB-tolC及其調(diào)控因子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在這八株外排泵缺失株中，acrAB-tolC及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因 ma

8、rA和 ramA的表達(dá)水平都顯著的增加(P<0.05)，而且其遷移力也有所增強(qiáng)。以上結(jié)果表明，沙門氏菌SH10可以通過(guò)marA和ramA來(lái)實(shí)現(xiàn)acrAB與其它外排泵間的相互調(diào)節(jié)。
　　在環(huán)丙沙星的選擇壓力下，我們?cè)隗w外篩選出鼠傷寒沙門氏菌臨床株SH10和標(biāo)準(zhǔn)株 SL1344的不同耐藥水平的誘導(dǎo)菌。其中 SH-1和 SL-1為敏感性降低株（MICcip為0.125μg/mL和0.25μg/mL），SH-2和 SL-2為低水平耐藥株（

9、MICcip均為2μg/mL），SH-3和SL-3為高水平耐藥菌（MICcip為8μg/mL）。QRDR突變檢測(cè)結(jié)果顯示，這些不同耐藥水平的誘導(dǎo)菌中，只在 GyrA的83位檢測(cè)到突變S83F。于是，我們又檢測(cè)了誘導(dǎo)菌中主要耐多藥泵acrAB-tolC及其主要的轉(zhuǎn)錄激活因子 ramA、marA和 soxS的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，隨著耐藥水平的升高，外排泵的表達(dá)水平也不斷隨之升高(P<0.05)，并且是由 ramA介導(dǎo)的。MIC結(jié)果顯示，高水

10、平耐壓株 SH-3和 SL-3表現(xiàn)為多重耐藥。另外我們也檢測(cè)了這些誘導(dǎo)菌的適應(yīng)性，結(jié)果顯示隨著細(xì)菌耐藥性的增加，細(xì)菌的生長(zhǎng)能力、細(xì)菌毒力和遷移力都呈現(xiàn)不斷下降的趨勢(shì)。
　　結(jié)論：當(dāng)鼠傷寒沙門氏菌 SH10耐多藥泵 acrAB功能失活時(shí)，細(xì)菌一方面可以通過(guò)全局性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子marA和ramA反饋性促進(jìn)acrAB的表達(dá)；另一方面，細(xì)菌可以通過(guò)激活marA和ramA的表達(dá)來(lái)促進(jìn)其它的外排泵的表達(dá)尤其是RND家族的外排泵，以補(bǔ)償細(xì)菌喪失