志賀菌主動外排泵AcrAB-TolC的基因調(diào)控研究.pdf

1、背景與目的：志賀菌屬細菌(簡稱志賀菌)是細菌性痢疾的病原體,細菌性痢疾至今仍是影響人類健康的主要腸道傳染病之一,20世紀60年代以來志賀菌對四環(huán)素等多種傳統(tǒng)抗生素普遍耐藥,80年代以來,喹諾酮類藥物,尤其是氟喹諾酮類藥物,因其抗菌譜廣,獨特的作用機制,優(yōu)秀的藥物動力學特征和良好的抗菌活性,成為臨床治療菌痢的一類藥物,然而,隨著該類藥的廣泛應用及濫用,致使細菌耐藥性迅速增加,耐藥性產(chǎn)生的直接后果是嚴重影響了臨床療效,增加了治療成本,同時縮

2、短了新藥的應用周期,增大了新藥的研究與開發(fā)成本。因此,深入研究抗生素的耐藥機制,進而探索解決其耐藥性的方法,開發(fā)新型抗菌藥物,以遏制或減緩細菌性痢疾耐藥的發(fā)展已迫在眉睫。近年來的研究表明,在一些細菌中存在主動外排現(xiàn)象,即細菌能將擴散進細胞內(nèi)的多種結(jié)構(gòu)不相關(guān)的抗菌藥物主動泵出細胞外,從而使細菌獲得耐藥性。研究較多的是大腸埃希氏菌AcrAB-TolC主動外排泵。其耐藥機制是由染色體介導的在一個調(diào)節(jié)位點控制下的多基因協(xié)作表型,其染色體上相關(guān)位

3、點的突變可導致細菌主動外排泵蛋白表達增加,從而將結(jié)構(gòu)不同的藥物泵出細胞膜外,致細胞內(nèi)藥物達不到有效濃度,即產(chǎn)生多重耐藥。AcrAB-TolC系統(tǒng)受多種調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié),常見的為AcrR抑制子與MarRAB操縱子。有研究報道AcrR抑制子對acrAB轉(zhuǎn)錄起一定程度的抑制作用;marRAB操縱子結(jié)構(gòu)包括:①啟動子marO;②阻遏基因marR;③編碼不連續(xù)的陽性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子marA;④marB。已有研究發(fā)現(xiàn),marO或marR突變時,marRAB

4、的轉(zhuǎn)錄去阻遏,致MarA超表達,從而激活AcrAB-TolC系統(tǒng),產(chǎn)生多重耐藥現(xiàn)象。但研究也發(fā)現(xiàn)may突變雖然集中發(fā)生在marOR區(qū)域內(nèi),并未發(fā)現(xiàn)一個突變熱點區(qū),在此區(qū)域內(nèi)任何位置的突變,似乎均可降低細菌對抗生素的敏感性,并且同其他耐藥突變相似,多個位點突變的積累和較大基因片斷的缺失會導致細菌高度耐藥。已有研究證實AcrAB-TolC主動外排泵在志賀菌中也存在,本課題組在前期工作中已擴增出志賀菌主動外排泵結(jié)構(gòu)基因acrAB-tolC,并

5、發(fā)現(xiàn)多重耐藥株acrA mRNA水平顯著高于敏感株。然而,在acrAB-tolC基因突變株與未突變株中,其mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義。提示acrAB-tolC基因本身突變不影響其表達改變,可能是受MarRAB操縱子、AcrR抑制子等調(diào)控的結(jié)果。本研究對志賀菌主動外排泵的調(diào)控基因進行了研究,以了解主動外排泵上游調(diào)控基因在志賀菌多重耐藥機制中所起的作用,并期望能在多重耐藥株主動外排泵調(diào)控基因上發(fā)現(xiàn)與多重耐藥關(guān)系密切的共有突變區(qū)。我們對

6、臨床收集的志賀菌進行有機溶劑耐受試驗檢測主動外排泵AcrAB-TolC的表達狀況,PCR擴增AcrAB-TolC的調(diào)控基因acrR、marOR,運用SSCP技術(shù)對其突變性進行檢測,利用核酸測序技術(shù)分析其具體的突變情況。
　　方法：1.菌株鑒定:對保存菌株在LB平板上劃線復蘇并重新進行生化及血清學鑒定,以保證菌株的可靠性。2.多重耐藥株和敏感株的篩選:藥物敏感試驗采用Kinby-Bauer紙片瓊脂擴散法,按照美國國立臨床實驗室標準委

7、員會(NCCLS)制定的指南進行。對實驗室收集的54株志賀菌進行四環(huán)素、氯霉素、氨芐青霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星等藥物的藥敏試驗,以對2種或以上不同類抗菌藥物耐藥者即可稱為多重耐藥株(Mar),對5種抗菌藥物均敏感的為敏感株,余者為單耐藥株。3.有機溶劑耐受試驗(Organic solvent tolerance,OST):待志賀菌增菌至對數(shù)中期,PBS緩沖液稀釋至10～6～10～7cells/ml,取5ul置于LB固體培養(yǎng)基上,待晾干后

8、覆蓋上正己烷、環(huán)己烷或二者的混合物(體積比,3:1,1:1,1:3),厚度約2～3mm,將固體培養(yǎng)基置于密封容器中,30℃孵育24～36h,若斑點出現(xiàn)融合生長,則為有機溶劑耐受,重復3次。4.志賀菌acrR、marOR基因的單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)分析:煮沸法提取模板DNA,PCR擴增acrR、marOR基因,擴增產(chǎn)物采用TaqI限制性內(nèi)切酶酶切,酶切產(chǎn)物變性后進行8％聚丙烯酸胺凝膠電泳,硝酸銀染色后觀察結(jié)果并照相,根據(jù)單鏈帶

9、數(shù)目和位置判斷有無基因突變。5.對志賀菌acrR、marOR基因突變菌株P(guān)CR產(chǎn)物進行核酸序列分析。
　　結(jié)果：1.菌株鑒定:共復蘇鑒定臨床分離志賀菌54株,其中福氏志賀菌41株,宋內(nèi)志賀菌10株、痢疾志賀菌3株。2.多重耐藥株和敏感株的篩選:根據(jù)54株志賀菌對四環(huán)素、氯霉素、氨芐青霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星等藥物的藥敏試驗結(jié)果,篩選出多重耐藥株35株,單耐藥株8株,敏感株11株。多重耐藥率為64.8%。3.志賀菌對有機溶劑的耐受試

10、驗:54株志賀菌中有38株對有機溶劑耐受,總耐受率為70.37%,其中33株為多重耐藥株,3株為單耐藥株,僅有2株為敏感株。多重耐藥株組對有機溶劑的耐受率為94.29%,顯著高于志賀菌非多重耐藥株組(26.32%),差異有顯著性(P<0.05)。4.acrR、marOR基因PCR擴增結(jié)果:35株多重耐藥株、8株單耐藥株和11株敏感株及志賀菌參考株全部擴增出acrR、marOR基因片段,分別為564bp和604bp,未發(fā)現(xiàn)這2個基因的缺失

11、。5.acrR、marOR基因SSCP分析結(jié)果:(1)acrR基因:全部多重耐藥株、單耐藥株、敏感株和參考株具有一致的單鏈構(gòu)象,未發(fā)現(xiàn)突變菌株。(2)marOR基因:在多重耐藥株中,有5株marOR基因存在突變,突變率為14.29%;在單耐藥株、敏感株和參考株中未發(fā)現(xiàn)突變。6.acrR、marOR基因PCR產(chǎn)物的核酸序列分析:(1)acrR基因:測序的3株多重耐藥株acrR基因序列與敏感株和參考株一致,未發(fā)現(xiàn)突變。(2)marOR基因:

12、與敏感株Z10和參考株S51250比較,5株突變的志賀菌多重耐藥株(H6、H12、N10、N13、198)在marO區(qū)1376-1379處均存在4個堿基(CATT)缺失,且有3株還存在2處點突變。
　　結(jié)論：1.志賀菌的多重耐藥率較高,且多重耐藥株對有機溶劑的耐受率遠高于其他菌株。2.在志賀菌中擴增出acrR、marOR,未發(fā)現(xiàn)該二基因缺失株,證實類似大腸埃希菌的主動外排系統(tǒng)AcrAB-TolC的調(diào)控基因acrR、marOR廣泛分