大腸桿菌K12外排泵及調控基因缺失菌株的構建及其功能的研究.pdf

1、細菌對抗生素耐藥性的產(chǎn)生伴隨著抗生素長期大量的使用，細菌耐藥性的產(chǎn)生方式有多種，其中對于革蘭氏陰性桿菌中的大腸桿菌而言，外排泵AcrAB-TolC是引起其對多種抗生素耐藥的一個最重要的系統(tǒng)，本文旨在研究外排泵基因或者部分調控基因缺失后菌株在環(huán)丙沙星選擇壓力下耐藥性的產(chǎn)生機制。
　　本研究首先利用Red同源重組建立了大腸桿菌K12染色體基因敲除技術，將以兩端攜帶FRT序列的質粒pKD3和pKD4為模板擴增出的PCR產(chǎn)物成功替代了大腸

2、桿菌K12中的acrA、acrB、tolC、marA、marR、soxS和soxR，獲得了外排泵基因及調控基因敲除菌，測定原菌K12以及7株敲除菌的生長曲線，利用半固體瓊脂方法測定了8株菌的移動能力，發(fā)現(xiàn)各敲除菌的生長速率以及移動能力沒有顯著改變。
　　在環(huán)丙沙星濃度遞增的條件下誘導K12及其敲除菌株，分別獲得系耐藥菌株，采用二倍稀釋法測定各菌株的MIC，利用PCR的方法檢測了gyrA、gyrB、parC和parE基因QRDR區(qū)的

3、突變以及負向調控因子acrR、marR、soxR突變情況。利用RT-PCR方法檢測了誘導突變株中外排泵基因、調控基因和膜孔蛋白基因的表達水平。結果表明，當敲除AcrAB-TolC中的tolC基因時，在濃度遞增的環(huán)丙沙星選擇壓力下很難篩選出耐藥菌株，說明AcrAB-TolC的完整性對菌株耐藥性發(fā)展有重要作用。誘導耐藥株靶位基因突變類型具有多樣性，與耐藥有關的突變位點有GyrA的Ser83Leu、Asp87Gly、Asp87His和ParC

4、的Gly78Asp。外排泵基因acrA或者acrB基因缺失的菌株，其獲得低水平耐藥主要與靶位基因突變有關，其獲得高水平耐藥主要由于與其存在功能冗余的外排泵AcrEF被激活，增加藥物外排所致。誘導耐藥發(fā)展過程中，菌株的膜孔蛋白OmpF的表達水平不斷下降，使得藥物進入細胞的通道減少。
　　正向調控基因marA和soxS缺失后，在環(huán)丙沙星選擇壓力下僅能篩選出對環(huán)丙沙星敏感性降低的菌株，而負調控基因marR和soxR缺失后，在環(huán)丙沙星選擇