抗體對大腸桿菌氟苯尼考主動外排泵的影響及臨床耐藥菌株監(jiān)測方法的建立.pdf

1、自從抗菌藥在臨床上使用以來，就在人類和動物感染性疾病治療中起到了重要的作用。但是，隨著抗生素和化療藥物的發(fā)展以及在臨床上的廣泛應用和濫用，尤其是獸醫(yī)臨床和飼料中的濫用，造成世界范圍內耐藥菌株迅速增加，導致抗生素效力逐漸下降甚至對某些病原菌束手無策，給畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康帶來了嚴重的潛在威脅。為了尋找解決臨床嚴重細菌耐藥問題的方法，我們針對動物專用新型廣譜抗生素氟本尼考，進行深入的耐藥機制的研究。 本文將耐氟苯尼考的floR基因部

2、分基因片段插入pGEX-4T-2原核表達載體中，構建以BL21(DE3)CodonPlus為宿主菌的原核表達體系。通過摸索IPTG的誘導濃度、誘導溫度和菌株收獲時間等條件，確定了floR1基因能在pGEX4T/BL21(DE3)codonplus中高效表達，且表達的重組蛋白為包涵體。采用超聲波裂解配以曲通-尿素對包涵體進行洗滌的方法在pGEX表達系中取得了較好的效果。使用分步透析法對變性的包涵體進行復性，將復性蛋白過GST親和層析柱得到

3、純化的GST-FloR1融合蛋白。并以GST-FloR1融合蛋白為抗原，成功制備出抗GST-FloR1融合蛋白的抗體。 為了進一步闡明氟苯尼考的耐藥機制，本文通過列floR基因上游調控序列的分析，成功構建了pGEM/floR及pBR322/floR質粒，隨后轉入到了基因工程菌JM109中，兩株工程菌均顯示對氯霉素和氟苯尼考耐藥。 利用研究建立的測定氟苯尼考在細菌內積聚的HPLC法測定了氟苯尼考在敏感和耐藥大腸桿菌內的積聚

4、及抗體孵育后藥物在敏感和耐藥大腸桿菌內的積聚。結果顯示耐氟苯尼考菌株比敏感菌株對氟苯尼考的積聚明顯降低，達到穩(wěn)態(tài)后，耐藥大腸桿菌對氟苯尼考的積聚約低于敏感大腸桿菌的3.5倍；與抗體孵育的耐藥菌，不管是實驗室構建的基因工程菌還是臨床分離菌，藥物在菌體內的蓄積量明顯增加，而對照敏感菌JM109，不管是否與抗體孵育，氟苯尼考在菌體內的蓄積量沒有明顯變化，這說明抗體能提高耐藥細菌對藥物的敏感性。結果在國內外首次初步證實了floR基因編碼的Flo

5、R蛋白在細胞膜上由質子驅動力介導并通過主動外排泵貢獻細菌對氟苯尼考的耐藥性。 利用純化的抗血清建立了ELISA方法并進行臨床氟苯尼考耐藥菌的監(jiān)測。在以多克隆抗體建立的ELISA方法中，用方陣滴定法確定包被抗原GST-FloR1的最適包被濃度為300ng/ml，抗血清的最高效價為1∶204800，抗血清純化后的最佳工作濃度為1∶6400，采用間接競爭ELISA法建立檢測FloR1的標準曲線，線性檢測范圍為6.25ng/ml～200