RNA干擾和合成小分子對(duì)大腸桿菌外排泵抑制作用研究.pdf

1、本研究分別采用RNA干擾技術(shù)和合成吲哚類(lèi)小分子抑制劑的方法，研究大腸桿菌主動(dòng)外排泵AcrAB-TolC對(duì)大腸桿菌耐藥性的影響。 通過(guò)對(duì)臨床分離480株豬源大腸桿菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)初步篩選耐藥菌株，使用氯霉素、四環(huán)素和氨基糖苷類(lèi)3類(lèi)抗生素耐藥基因PCR試劑盒進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，篩選出耐藥菌株Fj307。使用氯霉素對(duì)ATCC25922進(jìn)行人工誘導(dǎo)耐藥性，獲得耐藥菌株YD02。實(shí)驗(yàn)通過(guò)MIC檢測(cè)和耐藥基因PCR檢測(cè)，確認(rèn)該2株菌存在外排泵Acr

2、AB-TolC引起的耐藥性。 以大腸桿菌AcrAB-TolC外排系統(tǒng)中膜融合蛋白AcrA蛋白為干擾目標(biāo)，針對(duì)其編碼基因序列設(shè)計(jì)合成了4對(duì)siRNA干擾分子：siRNA35、siRNA164、siRNA929，siRNAcontrol通過(guò)生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)從表觀水平檢測(cè)該4對(duì)siRNA抑制外排泵活性的能力，干擾結(jié)果顯示：在干擾實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中7h～10h間時(shí)，在3種氯霉素濃度梯度下128、64、32(ug/mL)均能檢測(cè)出各siRNA實(shí)驗(yàn)組和

3、對(duì)照組間的吸光度數(shù)據(jù)存在差異(P＜0.01)，實(shí)驗(yàn)對(duì)氯霉素濃度32ug/mL實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，5個(gè)不同實(shí)驗(yàn)處理的吸光度在總體程度上差異極其顯著(P＜0.01)，其中siRNA164使耐藥菌吸光度降低到對(duì)照的1/4，和其他組的siRNA差異極顯著，說(shuō)明siRNA164能夠通過(guò)干擾外排泵關(guān)鍵蛋白AcrA造成大腸桿菌耐藥性的逆轉(zhuǎn)。 針對(duì)大腸桿菌AcrAB-TolC外排系統(tǒng)中外膜通道蛋白TolC的空間結(jié)構(gòu)，以TolC蛋白外膜出口處As

4、p153與Tyr362兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸設(shè)計(jì)小分子化合物作為外排泵抑制劑，實(shí)驗(yàn)使用6-氨基吲哚和6-甲酸甲酯吲哚為原料，通過(guò)化學(xué)方法合成了4個(gè)吲哚類(lèi)衍生物作為外排泵抑制劑。實(shí)驗(yàn)以Fj307、YD02為陽(yáng)性菌株，ATCC25922、Twlb為陰性對(duì)照，檢測(cè)小分子抑制劑加入后實(shí)驗(yàn)菌株在幾種抗生素條件下MIC的變化，結(jié)果顯示，合成的小分子使大腸桿菌對(duì)氯霉素、四環(huán)素、紅霉素類(lèi)和環(huán)丙沙星的MIC值下降最多達(dá)32倍，說(shuō)明有抑制活性。 對(duì)外排泵的