RNA干擾和合成小分子對大腸桿菌外排泵抑制作用研究.pdf

1、本研究分別采用RNA干擾技術(shù)和合成吲哚類小分子抑制劑的方法，研究大腸桿菌主動外排泵AcrAB-TolC對大腸桿菌耐藥性的影響。 通過對臨床分離480株豬源大腸桿菌進(jìn)行藥敏實驗初步篩選耐藥菌株，使用氯霉素、四環(huán)素和氨基糖苷類3類抗生素耐藥基因PCR試劑盒進(jìn)行聯(lián)合檢測，篩選出耐藥菌株Fj307。使用氯霉素對ATCC25922進(jìn)行人工誘導(dǎo)耐藥性，獲得耐藥菌株YD02。實驗通過MIC檢測和耐藥基因PCR檢測，確認(rèn)該2株菌存在外排泵Acr

2、AB-TolC引起的耐藥性。 以大腸桿菌AcrAB-TolC外排系統(tǒng)中膜融合蛋白AcrA蛋白為干擾目標(biāo)，針對其編碼基因序列設(shè)計合成了4對siRNA干擾分子：siRNA35、siRNA164、siRNA929，siRNAcontrol通過生長抑制實驗從表觀水平檢測該4對siRNA抑制外排泵活性的能力，干擾結(jié)果顯示：在干擾實驗進(jìn)行中7h～10h間時，在3種氯霉素濃度梯度下128、64、32(ug/mL)均能檢測出各siRNA實驗組和

3、對照組間的吸光度數(shù)據(jù)存在差異(P＜0.01)，實驗對氯霉素濃度32ug/mL實驗組進(jìn)行統(tǒng)計分析，5個不同實驗處理的吸光度在總體程度上差異極其顯著(P＜0.01)，其中siRNA164使耐藥菌吸光度降低到對照的1/4，和其他組的siRNA差異極顯著，說明siRNA164能夠通過干擾外排泵關(guān)鍵蛋白AcrA造成大腸桿菌耐藥性的逆轉(zhuǎn)。 針對大腸桿菌AcrAB-TolC外排系統(tǒng)中外膜通道蛋白TolC的空間結(jié)構(gòu)，以TolC蛋白外膜出口處As

4、p153與Tyr362兩個關(guān)鍵氨基酸設(shè)計小分子化合物作為外排泵抑制劑，實驗使用6-氨基吲哚和6-甲酸甲酯吲哚為原料，通過化學(xué)方法合成了4個吲哚類衍生物作為外排泵抑制劑。實驗以Fj307、YD02為陽性菌株，ATCC25922、Twlb為陰性對照，檢測小分子抑制劑加入后實驗菌株在幾種抗生素條件下MIC的變化，結(jié)果顯示，合成的小分子使大腸桿菌對氯霉素、四環(huán)素、紅霉素類和環(huán)丙沙星的MIC值下降最多達(dá)32倍，說明有抑制活性。 對外排泵的