大腸桿菌非編碼小RNA DsrA核磁結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、大腸桿菌DsrA是被研究得最清楚的調(diào)節(jié)非編碼小RNA之一。它位于調(diào)控莢膜多糖合成基因rcsA下游，全長87個(gè)核苷酸，并且調(diào)控時(shí)依賴于Hfq蛋白質(zhì)。當(dāng)細(xì)菌處于低溫或者酸性條件下，細(xì)菌會大量表達(dá)D srA sRNA，來調(diào)控rpoS和hns mRNA的活性，激活σS翻譯并且抑制H-NS表達(dá)，從而調(diào)控很多基因的轉(zhuǎn)錄。近兩年來，人們又發(fā)現(xiàn)DsrA可以抑制參與細(xì)胞壁合成的mreB和參與糖代謝的rbsD mRNA。
　　盡管有大量文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)了Ds

2、rA sRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能，但是它的原子分辨率結(jié)構(gòu)仍然不清楚。因此，使用核磁共振技術(shù)研究了DsrA結(jié)構(gòu)。首先，解析了DsrA第一個(gè)莖環(huán)(SL1)的三維結(jié)構(gòu)。SL1形成一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)A型RNA結(jié)構(gòu)，莖部結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定，但是由“AUUUC”組成的loop區(qū)柔性很大，具有動(dòng)態(tài)性。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和核磁共振技術(shù)，證明了rpos mRNA能夠與DsrASL1和隨后的單鏈區(qū)形成堿基配對，在不需要Hfq或者CsdA等蛋白質(zhì)的幫助下，就能打開SL1穩(wěn)定

3、的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
　　有不同文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)了DsrA有三個(gè)不同二級結(jié)構(gòu)模型。在這三個(gè)模型中，SL1和SL3的序列和二級結(jié)構(gòu)都是一樣的，但是SL2結(jié)構(gòu)卻有很大區(qū)別。進(jìn)一步確認(rèn)了在NMR條件下SL2的二級結(jié)構(gòu)，并且證明這個(gè)二級結(jié)構(gòu)與Lease和Belfort報(bào)導(dǎo)的二級結(jié)構(gòu)模型最一致。它的底部堿基配對非常不穩(wěn)定，當(dāng)溫度升高時(shí)就會被打開，而頂部可形成相對穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
　　筆者還發(fā)現(xiàn)SL2可以存在兩種構(gòu)象，而且SL25'端單鏈linker會

4、影響這兩種構(gòu)象的變化。為此，設(shè)計(jì)了幾個(gè)RNA，分別為Domain235nt(28-60核苷酸)，Domain230nt(33-60核苷酸)and Domain225nt(38-60核苷酸)。通過比較不同RNA的2D1H-1H NOESY譜圖，發(fā)現(xiàn)SL2頂部莖環(huán)會同時(shí)存在兩種結(jié)構(gòu)。雖然Domian2所有亞氨基信號都屬于A構(gòu)象，但是另外三個(gè)RNA都包含了另外一種構(gòu)象亞氨基信號。當(dāng)在Domain225nt加上更穩(wěn)定底部堿基配對時(shí)，兩種構(gòu)象都會

5、出現(xiàn)，而且這兩種構(gòu)象的交叉峰強(qiáng)度基本一樣。
　　雖然SL2結(jié)構(gòu)柔性很大，但是它的亞氨基信號在SL12和SL23中保持一致，說明SL12和SL23都能形成包含兩個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。但是當(dāng)DsrA全長在高濃度下時(shí)，只有SL1形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而SL2和SL3觀測不到任何亞氨基信號，因而沒有形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
　　RNA是功能最多樣的生物大分子。有時(shí)候一個(gè)RNA分子同時(shí)有多種功能，比如DsrA sRNA。當(dāng)RNA發(fā)揮不同的功能時(shí)，它可能