肺癌相關(guān)非編碼RNA的篩選及功能研究.pdf

1、目的：
　　肺癌是最致命的惡性腫瘤之一，在中國其發(fā)病率和死亡率均位于首位，嚴(yán)重威脅人們的生命健康和生活質(zhì)量，是中國的重大公共衛(wèi)生問題之一。探索肺癌的發(fā)病機(jī)理，尋找有效的肺癌篩查和早期診斷的生物標(biāo)志物，是降低肺癌發(fā)病率和死亡率的關(guān)鍵。本研究通過miRNA及l(fā)ncRNA芯片高通量篩選技術(shù)，結(jié)合TCGA大數(shù)據(jù)庫及生物信息學(xué)分析遴選肺癌相關(guān)候選生物標(biāo)志物;并進(jìn)一步擴(kuò)大人群樣本量，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測并分析miRNA和lncRNA

2、對肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響及其診斷價(jià)值;最后選取miR-30a-3p、miR-30a-5p及BRE-AS1進(jìn)一步探索其在肺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能及可能的調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步了解肺癌的發(fā)病機(jī)制、篩選肺癌診斷、治療生物標(biāo)志物提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.應(yīng)用miRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選肺癌組織及癌旁組織中差異表達(dá)miRNA，結(jié)合TCGA大數(shù)據(jù)庫及生物信息學(xué)分析構(gòu)建miRNA-mRNA表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步遴選出肺癌相關(guān)miRNA。采用RT

3、-qPCR技術(shù)在肺癌人群中對篩選出的差異表達(dá)miRNA進(jìn)行檢測，logistic回歸分析其異常表達(dá)與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，應(yīng)用ROC曲線下面積評估候選miRNA在肺癌中的診斷價(jià)值，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析候選miRNA表達(dá)水平與肺癌臨床特征之間關(guān)系。
　　2.應(yīng)用lncRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選差異表達(dá)lncRNA，結(jié)合TCGA大數(shù)據(jù)庫及生物信息學(xué)分析構(gòu)建lncRNA-mRNA表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步遴選出肺癌相關(guān)lncRNA。在肺癌人群中

4、采用RT-qPCR技術(shù)對篩選出的差異表達(dá)lncRNA進(jìn)行檢測，logistic回歸分析其異常表達(dá)與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，應(yīng)用ROC曲線下面積評估候選lncRNA在肺癌中的診斷價(jià)值，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析候選lncRNA表達(dá)水平與肺癌臨床特征之間關(guān)系。
　　3.利用miR-30a-3p mimic和miR-30a-5p mimic分別轉(zhuǎn)染A549肺癌細(xì)胞，構(gòu)建miR-30a-3p和miR-30a-5p過表達(dá)細(xì)胞模型，應(yīng)用RT-qP

5、CR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞中miR-30a-3p和miR-30a-5p表達(dá)情況，確定轉(zhuǎn)染效率。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析過表達(dá)miR-30a-3p和miR-30a-5p后對肺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及可能調(diào)控機(jī)制，包括MTT法檢測細(xì)胞生長增殖、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期、Annexin-ⅤFITC&PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡。Western Blot檢測PI3K-AKT-mTOR通路中關(guān)鍵蛋白水平的表達(dá)。
　　4.構(gòu)建lncRNA BRE-A

6、S1慢病毒過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染A549肺癌細(xì)胞構(gòu)建BRE-AS1過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型，應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)后A549細(xì)胞中BRE-AS1的表達(dá)情況，確定慢病毒轉(zhuǎn)染效率。進(jìn)一步在此基礎(chǔ)上分析過表達(dá)BRE-AS1對肺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響及可能調(diào)控機(jī)制，包括MTT法檢測細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期、Annexin-ⅤAPC&7-ADD雙染法檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力。Western Blot檢測PI3K-AKT-m

7、TOR通路中關(guān)鍵蛋白水平的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.肺癌相關(guān)microRNA的識別
　　1.1.肺癌microRNA差異表達(dá)譜分析
　　miRNA/mRNA表達(dá)譜芯片初步篩選出116個(gè)miRNA和502個(gè)mRNA表達(dá)發(fā)生改變。從TCGA數(shù)據(jù)庫篩選出154個(gè)差異表達(dá)miRNA及5322個(gè)差異表達(dá)mRNA。二者綜合分析，得到交集miRNA/mRNA有29個(gè)及417個(gè)。應(yīng)用starbase V2.0數(shù)據(jù)庫，Targe

8、tScan及miRTarbase預(yù)測miRNA靶基因，所得結(jié)果與芯片及TCGA交集417個(gè)mRNA構(gòu)建miRNA-mRNA表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖。應(yīng)用DIANA-mirPath V.3對29個(gè)潛在肺癌相關(guān)miRNA進(jìn)行通路分析，發(fā)現(xiàn)這些miRNA所調(diào)控靶基因主要參與Hippo、TGF-beta、Wnt、ErbB、MAPK signaling pathway等環(huán)境信息過程信號通路及非小細(xì)胞肺癌等人類疾病通路。
　　1.2.候選microRNA表

9、達(dá)水平與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及臨床特征關(guān)系的研究
　　通過RT-qPCR技術(shù)在91例人群組織樣本中檢測6個(gè)候選miRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示miR-205-5p表達(dá)顯著上調(diào)，miR-27a-5p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30c-2-3p和miR-30d-5p表達(dá)顯著下調(diào)(p＜0.001)，與芯片及TCGA數(shù)據(jù)庫所得結(jié)果一致。Logistic回歸分析顯示，miR-205-5p表達(dá)水平與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)正相關(guān)，增加其表達(dá)

10、水平可升高肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR值為1.287，p＜0.01);miR-27a-5p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30c-2-3p和miR-30d-5p的表達(dá)水平與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)負(fù)相關(guān)，增加其表達(dá)水平可降低肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（OR值分別為0.846、0.700、0.585、0.745、0.479，p＜0.01）。ROC特征曲線分析結(jié)果顯示，miR-205-5p、miR-27a-5p、miR-30a-3p、miR-30a-5

11、p、miR-30c-2-3p、miR-30d-5p單獨(dú)診斷AUC分別是0.728、0.637、0.758、0.772、0.734、0.776(p＜0.001)，聯(lián)合診斷AUC為0.898(p＜0.001)，聯(lián)合診斷敏感度和特異度分別為87.7％和84.9％，提示這些miRNA對肺癌有一定診斷效力、聯(lián)合診斷效果更佳。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-205-5p、miR-30a-3p、miR-30c-2-3p、miR-30d-5p異常表

12、達(dá)水平與肺癌患者病理分型有關(guān)(p＜0.05)，其表達(dá)差異在肺鱗癌中顯著高于肺腺癌。miR-30a-3p、miR-30c-2-3p異常表達(dá)水平與肺癌患者性別有關(guān)（p＜0.05），其表達(dá)差異在男性中顯著高于女性。miR-30a-5p、miR-30c-2-3p異常表達(dá)水平與肺癌患者的年齡相關(guān)(p＜0.05)，其表達(dá)差異在大于50歲患者中顯著高于小于50歲患者。提示在不同肺癌病理分型、年齡及性別群體中，miRNA的表達(dá)差異不盡相同，即在特定人群

13、中研究miRNA的表達(dá)可能對肺癌的診斷、治療及預(yù)后更有意義。
　　2.肺癌相關(guān)lncRNA的識別
　　2.1.肺癌lncRNA差異表達(dá)譜分析
　　2.2.候選lncRNA表達(dá)水平與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及臨床特征關(guān)系的研究
　　3.MiR-30a-3p和miR-30a-5p在肺癌中的生物學(xué)功能及機(jī)制研究
　　3.1.MiR-30a-3p和miR-30a-5p的生物信息學(xué)分析
　　3.2.MiR-30a-3p和m

14、iR-30a-5p對A549細(xì)胞的生物學(xué)功能研究
　　3.3.MiR-30a-3p和miR-30a-5p對PI3K-AKT-mTOR信號通路關(guān)鍵蛋白的調(diào)控研究
　　4.LncRNA BRE-AS1在肺癌中的生物學(xué)功能及機(jī)制研究
　　4.1.慢病毒LncRNA BRE-AS1過表達(dá)載體構(gòu)建
　　陽性克隆轉(zhuǎn)化子菌液測序結(jié)果與目的基因序列比對分析結(jié)果說明測序結(jié)果與目標(biāo)序列完全一致，BRE-AS1過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建成功

15、。
　　4.2.LncRNA BRE-AS1對A549細(xì)胞的生物學(xué)功能研究
　　4.3.LncRNA BRE-AS1對PI3K-AKT-mTOR信號通路關(guān)鍵蛋白的調(diào)控研究
　　結(jié)論：
　　1.本研究通過miRNA芯片、TCGA數(shù)據(jù)庫及miRNA-mRNA表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，在肺癌組織中篩選出29個(gè)差異表達(dá)miRNA。人群樣本檢測發(fā)現(xiàn)miR-205-5p在肺癌組織中高表達(dá)，與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)，miR-27a-5p、m

16、iR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30c-2-3p、miR-30d-5p在肺癌組織中低表達(dá)，與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)。提示miRNA聯(lián)合分析可提高肺癌的診斷效能，具有較高的應(yīng)用價(jià)值，在不同性別、年齡及病理類型的特定人群中進(jìn)一步開展肺癌相關(guān)miRNA研究可能更具有實(shí)際意義。
　　2.本研究通過lncRNA芯片、TCGA數(shù)據(jù)庫及l(fā)ncRNA-mRNA表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，在肺癌組織中篩選出11個(gè)差異表達(dá)LncRNA:MCTS2P

17、、SCARNA12、LOC728554、LHFPL3-AS2、SFTA1P、LINC00472、GVINP1、BRE-AS1、MIR22HG、LINC00312、MEIS3P1。人群樣本檢測首次發(fā)現(xiàn)LINC00312和BRE-AS1在肺癌組織中低表達(dá)，與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)。提示lncRNA聯(lián)合分析可提高肺癌的診斷效能，具有較高的應(yīng)用價(jià)值，在不同性別、年齡及病理類型的特定人群中進(jìn)一步開展肺癌相關(guān)lncRNA研究可能更具有實(shí)際意義。

18、>　　3.過表達(dá)miR-30a-3p和miR-30a-5p可抑制A549細(xì)胞增殖、引起細(xì)胞S期周期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加。二者可通過對PI3K-AKT-mTOR信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)影響參與肺癌的調(diào)控。
　　4.本研究首次研究BRE-AS1在肺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能及機(jī)制，過表達(dá)BRE-AS1可抑制A549細(xì)胞增殖、改變細(xì)胞G2/M周期比例、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加，BRE-AS1可通過對PI3K-AKT-mTOR信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)