長非編碼RNA FEZF1-AS1促進非小細胞肺癌惡性進展的功能和機制研究.pdf

1、目的：
　　長非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是既往研究中常被忽視的一類基因，然而近來的研究結(jié)果證明lncRNA廣泛參與了各種生理和病理過程，在腫瘤的發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移等過程中也扮演關(guān)鍵角色，在非小細胞肺癌(non-smallcell lung cancer，NSCLC)中也發(fā)揮著重要調(diào)控作用。
　　方法：
　　本研究首先通過lncRNA表達譜芯片，去核糖體RNA測序和公共數(shù)據(jù)平臺挖掘

2、注釋三種策略，全面系統(tǒng)地研究了NSCLC中的lncRNA表達圖譜，并發(fā)現(xiàn)大量在NSCLC中存在差異表達的lncRNA;結(jié)合生物信息學(xué)分析和the CancerGenome Atlas(TCGA)數(shù)據(jù)，我們鑒定篩選出一個在NSCLC組織中顯著上調(diào)的lncRNA: FEZF1 antisense RNA1(FEZF1-AS1，以下簡稱F1);在NSCLC組織樣本中驗證了F1的臨床相關(guān)性，并通過體內(nèi)和體外實驗研究F1可能的生物學(xué)功能。染色質(zhì)免

3、疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)和熒光素酶雙報告基因?qū)嶒炗糜谘芯縞-Myc對F1表達的調(diào)控。RNA免疫共沉淀(RNAimmunoprecipitation，RIP)和ChIP研究F1對下游基因的調(diào)控機制。
　　結(jié)果：
　　通過qRT-PCR和組織原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)在NSCLC患者中，F(xiàn)1的高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著正相關(guān);生存分析結(jié)果顯示高表達F1的患者預(yù)后較低表達者更差

4、。我們設(shè)計了特異性干擾F1的小干擾RNA(small interferingRNA，siRNA)并構(gòu)建了過表達F1的質(zhì)粒，體外細胞功能學(xué)實驗結(jié)果表明干擾F1可以顯著抑制NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲能力并促進凋亡;而過表達F1的結(jié)果則相反。通過裸鼠皮下荷瘤模型和尾靜脈轉(zhuǎn)移模型，我們發(fā)現(xiàn)敲減F11之后NSCLC細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力顯著受到抑制。
　　轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析發(fā)現(xiàn)F1上游存在c-Myc結(jié)合位點E-Box，ChIP和熒光素

5、酶報告基因?qū)嶒炞C實c-Myc可以結(jié)合在F1基因上游的E-Box區(qū)域促進F1的轉(zhuǎn)錄。通過c-Myc和F1的拯救實驗，我們發(fā)現(xiàn)F1部分介導(dǎo)了c-Myc的生物學(xué)功能。在NSCLC細胞中敲減F1之后進行轉(zhuǎn)錄組測序，尋找發(fā)生差異表達的基因，基因集富集分析發(fā)現(xiàn)多梳狀沉默復(fù)合物2(polycomb repressive complex2，PCR2)調(diào)控對基因集在差異表達基因中被顯著富集。RIP實驗證實F1可以與PRC2的關(guān)鍵亞基EZH2綁定，在敲減F

6、1之后，ChIP實驗證實SPRY2、KLF15、GLIPR1基因啟動子區(qū)EZH22富集減少，而且組蛋白3賴氨酸27位點三甲基化水平也顯著下降。
　　結(jié)論：
　　本研究系統(tǒng)地研究了NSCLC中l(wèi)ncRNA的表達圖譜，并鑒定出F1是肺癌增殖、轉(zhuǎn)移的重要基因，闡明了F1綁定EZH2抑制下游基因轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳學(xué)機制;本研究從lncRNA角度揭示了NSCLC增殖和轉(zhuǎn)移的分子機制，為NSCLC診斷、治療及預(yù)后評估提供了新的理論依據(jù)和靶標