長非編碼RNA ANRIL下調KLF2的表達促進肝癌細胞增殖的機制研究.pdf

1、肝細胞癌（以下簡稱為肝癌）為肝癌的主要病理類型，其死亡率位居我國惡性腫瘤死因第二位，是嚴重影響我國居民健康的惡性疾病。關于其發(fā)病的分子機制，仍未完全闡明，研究表明眾多l(xiāng)ncRNAs在多種腫瘤包括肝癌中表達異常，且與腫瘤細胞的增殖、細胞周期進程改變、凋亡、以及侵襲遷移等生物學行為密切相關，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。
　　lncRNA ANRIL(antisense noncoding RNA in the INK4 Locus)定位于

2、9q21染色體上，是細胞周期激酶抑制子4b(INK4b)位點的反義非編碼RNA，它通過調節(jié)INK4b-ARF-INK4a抑制p15INK4b和p16INK4a等抑癌因子和激活Ras通路從而延緩細胞衰老以及促進腫瘤發(fā)生及發(fā)展。研究表明ANRIL與胃癌、食管癌等腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關，但其在肝癌中的表達情況及其具體的生物學功能尚不清楚，需進一步研究。
　　本課題中，我們通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測77例肝癌患者癌組織

3、及癌旁組織中ANRIL的表達水平，發(fā)現(xiàn)其表達水平在肝癌組織中較癌旁組織顯著上調(P＜0.01)，結合臨床病理資料分析發(fā)現(xiàn)，ANRIL的表達水平與肝癌患者的腫瘤大小(P＜0.01)、BCLC分期（P＜0.01)密切相關，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，ANRIL在肝癌細胞系（HepG2，Hep3B，MHCC-97H）中的表達較肝正常細胞系(L02)顯著上調(P＜0.01);MTT、克隆形成、transwell實驗、流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)肝癌細胞中干擾ANR

4、IL能抑制細胞增殖、侵襲轉移能力，并誘導細胞凋亡;定量PCR及Western blotting結果顯示KLF2 mRNA及蛋白的表達在干擾ANRIL后顯著上調;核質分離實驗發(fā)現(xiàn)ANRIL亞細胞定位主要位于核內，RIP實驗結果證實ANRIL可以與SUZ12及EZH2結合，ChIP實驗證實EZH2及SUZ12可與KLF2啟動子區(qū)結合，提示KLF2可能是ANRIL下游的重要靶基因;進一步干擾EZH2和SUZ12后KLF2表達水平顯著上調;過表

5、達KLF2后發(fā)現(xiàn)肝癌細胞增殖及克隆形成能力明顯下降，并能阻滯肝癌細胞周期進程于G1期，同時也能明顯的促進肝癌細胞的凋亡;生物信息學分析發(fā)現(xiàn)ANRIL可能受到SP1調控，過表達及干擾SP1表達后ANRIL表達量隨之改變，ChIP實驗進一步證實SP1可與ANRIL的啟動子區(qū)結合。
　　綜上所述，本研究提示:肝癌中SP1促進ANRIL的轉錄，并通過綁定PRC2復合物介導KIF2啟動子區(qū)的組蛋白H3K27三甲基化抑制其轉錄，促進肝癌細胞惡