長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTAIR促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展的機(jī)制研究.pdf

1、目的：檢測(cè)正常子宮內(nèi)膜組織和內(nèi)膜癌組織中HOTAIR的表達(dá)，并分析其與臨床病理特征之間的關(guān)系。深入探索HOTAIR對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖，侵襲及體內(nèi)成瘤及轉(zhuǎn)移能力的影響。并探討HOTAIR調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖及侵襲機(jī)制。
　　方法：利用qRT-PCR技術(shù)和原位雜交方法檢測(cè)了臨床組織中HOTAIR的表達(dá)情況，并對(duì)HOTAIR表達(dá)與患者臨床病理特征之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析。利用數(shù)據(jù)挖掘，對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利

2、用AN3CA，KLE，SPEC-2，HEC-1B，RL-95，Ishikawa等細(xì)胞株經(jīng)過一系列體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)HOTAIR對(duì)細(xì)胞株的增殖、侵襲的影響。利用450K人甲基化芯片檢測(cè)HOTAIR對(duì)下游基因甲基化的影響。HOXA10被鎖定為HOTAIR其下游靶向基因。并進(jìn)一步在臨床標(biāo)本和細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了兩者的關(guān)系。
　　結(jié)果：與正常內(nèi)膜組織相比，內(nèi)膜癌組織HOTAIR表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.001）。且HOTAIR表達(dá)水平與臨床分期

3、（P<0.05）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P<0.05）呈正相關(guān)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)高表達(dá)HOTAIR的內(nèi)膜癌患者較低HOTAIR表達(dá)患者，生存期顯著下降（P<0.05）。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HOTAIR能夠促進(jìn)內(nèi)膜癌細(xì)胞株的增殖及侵襲能力。相反，沉默HOTAIR則抑制了內(nèi)膜癌細(xì)胞株的增殖與侵襲能力。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HOTAIR促進(jìn)了內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。HOXA10在過表達(dá)HOTAIR的細(xì)胞株中甲基化明顯。而恢復(fù)HOXA10的表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)過表達(dá)

4、HOTAIR造成的細(xì)胞生物學(xué)行為的改變。
　　結(jié)論：HOTAIR在子宮內(nèi)膜癌中顯著高表達(dá)；HOTAIR高表達(dá)與內(nèi)膜癌預(yù)后正相關(guān)。HOTAIR能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。HOTAIR通過靶向HOXA10調(diào)控子宮內(nèi)膜癌的細(xì)胞生物學(xué)行為。
　　第一部分 HOTAIR在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及其臨床意義
　　目的：檢測(cè)正常子宮內(nèi)膜組織和內(nèi)膜癌組織中HOTAIR的表達(dá)，并分析其與臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　方

5、法：利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了66例內(nèi)膜癌冰凍組織和30例正常內(nèi)膜冰凍組織中HOTAIR的表達(dá)；利用原位雜交技術(shù)對(duì)129例福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織切片（其中包括96例冰凍組織，21例其他內(nèi)膜癌組織和12例不典型增生組織）進(jìn)行HOTAIR表達(dá)檢測(cè)及評(píng)分。并對(duì)HOTAIR表達(dá)與患者臨床病理特征之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析。利用數(shù)據(jù)挖掘，對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　結(jié)果：與正常內(nèi)膜組織相比，內(nèi)膜癌組織H

6、OTAIR表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.001）。且HOTAIR表達(dá)水平與臨床分期（P<0.05）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P<0.05）呈正相關(guān)。FFPE組織的原位雜交結(jié)果顯示，HOTAIR表達(dá)上調(diào)也與肌層浸潤(rùn)深度（P=0.019）以及淋巴血管間隙浸潤(rùn)（P=0.015）相聯(lián)系。更重要的是，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)高表達(dá)HOTAIR的內(nèi)膜癌患者較低HOTAIR表達(dá)患者，生存期顯著下降（P<0.05）。
　　結(jié)論：HOTAIR在子宮內(nèi)膜癌中顯著高表達(dá)； HO

7、TAIR高表達(dá)與內(nèi)膜癌預(yù)后正相關(guān)，提示HOTAIR可能促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的惡性進(jìn)展。
　　第二部分 HOTAIR促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖及侵襲功能
　　目的：檢測(cè)不同子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中HOTAIR的表達(dá)，探索HOTAIR對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖，侵襲及體內(nèi)成瘤及轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　方法：Realtime PCR檢測(cè)AN3CA，KLE，SPEC-2，HEC-1B，RL-95，Ishikawa五株子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中HOTAIR的表

8、達(dá)。通過構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒和發(fā)夾狀RNA（shRNA），對(duì)高表達(dá)HOTAIR的AN3CA進(jìn)行下調(diào)HOTAIR，而低表達(dá)的Ishikawa上調(diào)HOTAIR的表達(dá)。并在體外進(jìn)行 CCK8，平板克隆，Transwell小室，劃痕實(shí)驗(yàn)等功能實(shí)驗(yàn)研究HOTAIR改變內(nèi)膜癌細(xì)胞株增殖及侵襲能力。包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒，構(gòu)建HOTAIR過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株IshikawaHOTAIR細(xì)胞株并進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，包括裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)，腹腔轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)及尾靜脈遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)HOTAI

9、R體內(nèi)改變內(nèi)膜癌細(xì)胞株的增殖及侵襲能力。
　　結(jié)果：在未分化轉(zhuǎn)移癌AN3CA細(xì)胞中表達(dá)最高，而在低分化的Ishikawa細(xì)胞中表達(dá)最低。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AN3CA下調(diào)HOTAIR后增殖、遷移和侵襲能力得到明顯抑制；而過表達(dá)HOTAIR的Ishikawa細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力則顯著增強(qiáng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HOTAIR的Ishikawa細(xì)胞增殖及侵襲能力顯著增強(qiáng)。
　　結(jié)論：HOTAIR能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。<

10、br>　　第三部分 HOTAIR通過靶向HOXA10從而影響子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生物學(xué)行為
　　目的：探討HOTAIR調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖及侵襲機(jī)制，探索HOTAIR通過靶向HOXA10甲基化來調(diào)控內(nèi)膜癌進(jìn)展的可能。
　　方法：構(gòu)建HOTAIR過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株IshikawaHOTAIR和Ishikawacontrol，利用450K人甲基化芯片進(jìn)行兩組細(xì)胞株之間的基因甲基化差異篩查。對(duì)差異甲基化改變的基因進(jìn)行聚類分析，篩選出不同H

11、OTAIR表達(dá)情況下甲基化差異表達(dá)的基因。我們把目標(biāo)基因鎖定為甲基化明顯的HOXA10基因。并用westernblot，qRT-PCR等方法對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。并通過過表達(dá)HOXA10進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。最后在正常子宮內(nèi)膜（20例）和子宮內(nèi)膜癌組織（40例）進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)HOXA10和原位雜交檢測(cè)HOTAIR，并進(jìn)行染色評(píng)分，驗(yàn)證兩者表達(dá)相關(guān)性。
　　結(jié)果：甲基化芯片發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HOTAIR的穩(wěn)轉(zhuǎn)株較對(duì)照組的細(xì)胞株，有24566

12、條基因甲基化差異明顯，其中高甲基化改變的達(dá)18136條。HOXA10CpG島處高甲基化明顯。高表達(dá)HOTAIR的穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞中HOXA10的mRNA和蛋白表達(dá)均下降。再構(gòu)建HOXA10的高表達(dá)質(zhì)粒，通過拯救實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HOXA10能夠逆轉(zhuǎn)HOTAIR誘導(dǎo)的細(xì)胞生物學(xué)行為的改變。與正常內(nèi)膜組織相比，HOXA10在內(nèi)膜癌組織中表達(dá)顯著下降，而且其與HOTAIR表達(dá)明顯負(fù)相關(guān)（P=0.0373）。
　　結(jié)論：HOTAIR通過靶向HOXA10