癌胚性長(zhǎng)鏈非編碼RNA Ptn-dt在小鼠肝癌中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)性肝細(xì)胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC，以下簡(jiǎn)稱肝癌）是世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一。盡管針對(duì)肝癌病人的治療方法在不斷完善，治療策略在不斷提高，但是病人的5年生存率依然很低。一個(gè)很重要的原因就是人們對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制認(rèn)識(shí)小清，缺乏肝癌早期診斷的有效手段，使得大量處于肝癌早期的病人不能得到及時(shí)診斷，從而失去了治療的最佳時(shí)機(jī)。因此，深入對(duì)HCC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中分子機(jī)制的研究，尋找可用于HCC診斷

2、的更有效的標(biāo)志分子，是一件刻不容緩的工程。
　　長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNAs）是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的RNA分子。近幾年的研究顯示，lncRNAs在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。此外，早在20世紀(jì)70年代，已經(jīng)有科學(xué)家提出腫瘤的發(fā)生過(guò)程模擬胚胎發(fā)育的過(guò)程，例如，在胚胎期特異性高表達(dá)的甲種胎兒球蛋白就是目前肝癌診斷和預(yù)后評(píng)估最有效的標(biāo)志分子。因此本課題以“癌胚性”為切入點(diǎn)，通過(guò)對(duì)小鼠胎肝組織和肝癌組織中同

3、時(shí)高表達(dá)的lncRNAs進(jìn)行篩選和功能研究，尋找更多可用于肝癌診斷和治療的標(biāo)志性的lncRNAs分子。
　　在本研究中，我們從小鼠的胎肝組織、成肝組織和肝癌組織的lncRNAs芯片中，發(fā)現(xiàn)了大量差異表達(dá)的lncRNAs分子。我們將在成年期不表達(dá)，而在胚胎期和腫瘤期同時(shí)高表達(dá)的這一類lncRNAs分子稱為癌胚性的lncRNAs分子。從多個(gè)候選癌胚性的lncRNAs分子中，我們靶定了一個(gè)新的癌胚性的lncRNA分子，根據(jù)其與鄰近編碼基

4、因(Pleiotrophin，Ptn)的位置關(guān)系，我們將其命名為lncRNA Ptn-dt（Pleiotrophindownstream transcript），以下簡(jiǎn)稱為Ptn-dt。我們利用real-time PCR、Northern blot和RNA熒光原位雜交技術(shù)(RNA FISH)，明確了Ptn-dt的癌胚特性，同時(shí)，Northernblot的結(jié)果顯示，Ptn-dt獨(dú)立存在于小鼠的轉(zhuǎn)錄組中，RNAFISH的結(jié)果顯示，Ptn-d

5、t主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。之后，我們利用5'，3'RACE技術(shù)，獲得了Ptn-dt的轉(zhuǎn)錄本全長(zhǎng)。在小鼠的肝癌細(xì)胞系Hepa1-6細(xì)胞中，分別構(gòu)建了Ptn-dt過(guò)表達(dá)和干擾Ptn-dt表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。通過(guò)一系列的體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)，Ptn-dt具有促進(jìn)小鼠肝癌細(xì)胞增殖的作用。
　　在明確Ptn-dt促進(jìn)小鼠肝癌細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)上，我們又對(duì)Ptn-dt的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探索。通過(guò)RNA pulldown實(shí)驗(yàn)和RNA免疫共沉淀（RIP）

6、實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)，Ptn-dt與HuR蛋白之間存在相互作用關(guān)系。研究報(bào)道，HuR是一個(gè)RNA結(jié)合蛋白，可以穩(wěn)定許多RNA分子，并調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。同時(shí)RIP的結(jié)果證實(shí)，HuR蛋白與miR-96之間存在相互作用關(guān)系。而我們的研究發(fā)現(xiàn)，Ptn-dt的過(guò)表達(dá)可引起miR-96下調(diào)表達(dá)。已有研究報(bào)道，真菌天然產(chǎn)物azaphilone-9與HuR的結(jié)合能夠在體外抑制HuR與RNA分子之間的相互作用。由此我們推測(cè)，Ptn-dt與HuR的結(jié)合，可能影響了HuR與

7、miR-96的結(jié)合，從而使得miR-96的穩(wěn)定性降低，表達(dá)水平減低。隨后，在miR-96眾多的靶分子中，我們發(fā)現(xiàn)Alk(Anaplastic lymphoma kinase)是Ptn的受體蛋白。研究報(bào)道，Ptn對(duì)其受體Alk有激活作用，而且Ptn可通過(guò)Alk促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和血管異常的發(fā)生。同時(shí)，我們的研究發(fā)現(xiàn)，Ptn-dt的過(guò)表達(dá)，可促進(jìn)Alk在mRNA水平以及蛋白水平的表達(dá)。因此，根據(jù)以上研究結(jié)果和研究報(bào)道，我們初步推斷:Ptn-dt

8、與HuR的結(jié)合，可能影響了HuR與miR-96的結(jié)合，使得miR-96的穩(wěn)定性降低，表達(dá)減少，從而減弱了miR-96對(duì)Alk的轉(zhuǎn)錄后抑制作用。最終，Alk表達(dá)增加，增強(qiáng)了Ptn的生物學(xué)功能，從而實(shí)現(xiàn)了Ptn-dt的促增殖作用。簡(jiǎn)而言之，癌胚分子Ptn-dt可能是通過(guò)HuR/miR-96/Alk通路和pleiotrophin-Alk軸來(lái)實(shí)現(xiàn)自身的促增殖作用的。
　　概括來(lái)講，本研究首次報(bào)道了Ptn-dt在肝癌中的促增殖作用，并對(duì)Pt