長鏈非編碼RNA在脊柱轉移瘤及肝細胞癌中的作用與臨床意義研究.pdf

1、隨著環(huán)境污染及食品安全問題日趨嚴重，吸煙、飲酒等不良生活習慣逐漸向年輕化發(fā)展，致使腫瘤發(fā)病率逐年增高。目前腫瘤已經成為威脅人類健康的重大疾病。我國不管發(fā)病率還是死亡率均居世界前列，給國民健康造成了極大的危害。腫瘤及其相關并發(fā)癥的研究越來越被研究者們所重視。雖然近些年在腫瘤診斷方法及治療手段上已取得長足的進步。但對于肺癌、肝癌、胰腺癌等惡性腫瘤的治療效果、預后和遠期生存率仍然較差。其主要原因歸結為對腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的認識不夠深入。

2、　　脊柱為腫瘤骨轉移最為常見的部位，高達70％的癌癥患者會發(fā)生脊柱轉移。脊柱轉移瘤可導致脊髓壓迫及病理性骨折，使患者癱瘓，完全失去自理能力。嚴重影響患者的生活質量，從而加速病情的進展。至今國內外學者對腫瘤脊柱轉移的機制尚不清楚，致使缺乏有效的治療方法。因此脊柱轉移瘤的治療仍然是困擾醫(yī)學界的一大難題。手術雖然能有效促進恢復，但并發(fā)癥多，創(chuàng)傷較大且短時間內容易復發(fā)，使部分患者在術后一月內死亡。因此，探尋介導腫瘤脊柱轉移的關鍵靶分子，是提高脊

3、柱轉移瘤病人臨床療效，改善患者預后及生存質量的新方向。
　　部分腫瘤具有較強的嗜骨性，晚期容易發(fā)生骨轉移，例如肝癌、肺癌、乳腺癌等。脊柱為肝癌骨轉移最為常見的部位，發(fā)生脊柱轉移患者存活率不到3%。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種全球范圍內常見的惡性腫瘤，占原發(fā)性肝癌的90%以上?；颊叱３０橛懈蝺燃案瓮廪D移。HCC早期臨床癥狀及體征多不典型，很難及早發(fā)現(xiàn)。明確診斷時大多病程已進入中、晚期，失

4、去手術機會。因其惡性程度高、早期發(fā)現(xiàn)難、進展速度快、治療復雜、術后復發(fā)及轉移率較高等特點，使HCC患者療效不佳，預后較差。以往對HCC研究主要以microRNA及編碼蛋白的RNA為主，長鏈非編碼RNA研究相對較少。目前國內外對HCC的分子機制研究還不夠深入，因此我們需進一步對HCC在發(fā)生、發(fā)展及轉移過程中的分子生物學機制進行探索。尋找可預測HCC發(fā)生的分子標志物，為HCC診療開辟新途徑。
　　人類基因組是由龐大且復雜的核苷酸序列排

5、列而成。目前已知可編碼蛋白的基因僅占人類基因組序列的2%，其余98%不具備編碼蛋白能力的序列被認為是基因組中無用的“噪聲”。這類從基因組轉錄而來，且不編碼蛋白的RNA分子稱為非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)。早期，研究者僅僅對編碼RNA進行關注，但近年來人們的目光逐漸被非編碼RNA所吸引。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)與人類多種疾病如阿爾茨海默癥、

6、腫瘤、亨廷頓氏病的發(fā)生、發(fā)展存在著重要的關系。
　　LncRNA轉錄本長度大于200nt，且不具備蛋白編碼的能力。最新研究表明， lncRNA在生命活動過程中扮演著重要角色，可通過調控mRNA和蛋白表達水平影響生物學行為。目前越來越多的腫瘤相關lncRNA得以發(fā)現(xiàn)，其通過多種方式調控著腫瘤的生長、轉移、侵潤與凋亡，成為全新腫瘤標志物及藥物靶標，顯著推進了腫瘤研究的進展。
　　Ji等通過測序技術發(fā)現(xiàn)了肺腺癌轉移相關轉錄本（me

7、tastasis-associated lung adenocarcinoma transcript1，MALAT1），對225例Ⅲ期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者進行篩查。發(fā)現(xiàn)70例轉移患者的樣本中MALAT1過表達，且具有病程及組織特異性。提示MALAT1可作為Ⅰ期NSCLC患者潛在標志物。該基因在其他腫瘤中也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，但在NSCLC患者中的表達最為顯著。MALAT1可通過激活

8、腫瘤轉移相關基因來促進腫瘤轉移，還可參與mRNA前體的可變剪切和絲氨酸/精氨酸剪接因子的磷酸化修飾，來影響基因的功能及表達。
　　隨著對腫瘤基因組學及轉錄組學研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)不但同種腫瘤中可存在不同的lncRNA，而且同一lncRNA也可在不同腫瘤中差異表達。HULC最早發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞中過表達，可作為原發(fā)性肝癌較為敏感的分子標志物，其在前列腺癌、胃癌中也出現(xiàn)異常表達情況。H19作為一個原癌基因，在多種消化系統(tǒng)腫瘤中表達量

9、升高。
　　綜上所述，lncRNA在腫瘤學研究中發(fā)揮著至關重要的作用。目前，脊柱轉移瘤患者多采取微創(chuàng)治療方案，脊柱后路開放式手術相對較少。因此組織樣本較為珍貴，收集相對困難，且骨組織RNA較難提取。致使國內外對于lncRNA在脊柱轉移瘤中的研究尚處空白。LncRNA在HCC中的研究仍然較少，并且絕大多數lncRNA調控機制尚不明確。由此提示我們，是否可以通過高通量測序技術進行篩選及驗證，找到全新的關鍵lncRNA作為腫瘤診斷及治療

10、靶標，為脊柱轉移瘤和HCC臨床診療提供新策略?；诖宋覀冮_展了以下三部分研究，現(xiàn)總結如下。
　　第一章：脊柱轉移瘤轉錄組lncRNA表達譜分析
　　目的：
　　建立脊柱轉移瘤差異表達lncRNA及mRNA表達譜，并對其長度及外顯子數量進行預測。明確差異表達mRNA可富集的分子功能、生物學過程和疾病通路相關信息。
　　方法：
　　對脊柱轉移瘤患者配對組織（腫瘤組織及癌旁組織）中RNA進行提取，利用高通量測序技

11、術構建脊柱轉移瘤中差異表達lncRNA及mRNA表達譜。隨后通過pathway分析及GO分析對差異表達mRNA的分子功能、參與生物學過程及疾病通路進行富集。最后對差異表達lncRNA長度及外顯子數目進行預測，并通過對比與編碼基因間位置關系，將差異表達lncRNA分類。
　　結果：
　　通過高通量測序技術，在脊柱轉移瘤組織中找到171條差異表達lncRNA和2929條差異表達mRNA，其中有66條全新未被報道的lncRNA。對

12、差異表達mRNA進行pathway分析和GO分析。結果顯示，脊柱轉移瘤中差異表達的mRNA可富集到31種疾病，79種通路及1535種分子功能，其中包括腫瘤相關疾病及腫瘤相關通路。進一步明確了脊柱轉移瘤中異常表達mRNA參與的分子功能、生物學過程和對疾病通路的調節(jié)。171條差異表達lncRNA中，大部分外顯子數目小于5個，長度小于10000nt，均少于mRNA。其中Antisense共有50條，已知的19條，未知的31條；Sence共有5

13、3條，已知的51條，未知的2條；Bidirectionsl共有6條，已知的4條，未知的2條；Intergenic共有40條，已知的20條，未知的20條；Intronic共有22條，已知的8條，未知的14條。
　　結論：
　　成功構建了脊柱轉移瘤lncRNA、mRNA表達譜。在171條差異表達lncRNA中發(fā)現(xiàn)66條全新未被報道的lncRNA。明確了2929條差異表達mRNA參與的分子功能、生物學過程和對疾病通路的調節(jié)。為腫瘤

14、學研究及后續(xù)實驗提供了寶貴的數據資源。
　　第二章：lnc000489在脊柱轉移瘤患者血漿中的表達及臨床特征相關性分析
　　目的：
　　通過在血漿中驗證，找出脊柱轉移瘤患者血漿中高表達的lncRNA。
　　了解其分子功能、生物學過程和疾病通路相關信息。明確其在脊柱轉移瘤中的診斷價值。
　　方法：
　　從前期構建的脊柱轉移瘤lncRNA表達譜中挑選20條全新的lncRNA。將脊柱轉移瘤患者血漿設為實驗組

15、，健康志愿者血漿設為對照組。通過qRT-PCR實驗檢測候選lncRNA在血漿中表達量，統(tǒng)計分析后找出在脊柱轉移瘤中具有顯著差異的lncRNA。利用ROC曲線計算靈敏度和特異性。隨后對差異表達lncRNA進行共表達分析，并對共表達mRNA進行pathway和GO分析。最后統(tǒng)計分析差異表達lncRNA與臨床特征間的相關性。
　　結果：
　　脊柱轉移瘤患者血漿中l(wèi)nc00489表達量相對于健康志愿者顯著升高（P<0.05），ROC

16、曲線分析顯示lnc00489對脊柱轉移瘤具有一定的診斷價值。與lnc00489存在共表達關系的mRNA共有51條，可富集到實體腫瘤、卵巢癌、口腔癌、前列腺癌等多種腫瘤相關疾病和Wnt、Hh、Hedgehog signaling pathway、Basal cell carcinoma等腫瘤相關通路，進一步說明了lnc00489可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移存在相關性。Lnc00489表達量與臨床特征進行相關性分析，顯示lnc00489與轉

17、移椎體個數及是否伴有內臟轉移顯著相關。轉移椎體數量越多病情相對嚴重。腫瘤主要的轉移途徑為血運轉移，內臟及椎體血供相對豐富。綜上所述lnc00489可能在腫瘤脊柱轉移的過程中發(fā)揮著重要作用，其有望成為潛在的血漿標志物，為脊柱轉移瘤的診斷及治療提供了新思路。
　　結論：
　　Lnc00489表達量在脊柱轉移瘤患者血漿中顯著升高，對脊柱轉移瘤具有一定的診斷價值。與lnc00489共表達的mRNA可富集到多種腫瘤相關疾病和通路。血漿

18、中l(wèi)nc00489表達量與轉移椎體數量和是否伴有內臟轉移具有相關性，其有望成為診斷脊柱轉移瘤全新的血漿分子標志物。
　　第三章：lnc34822在HCC患者血漿中表達及臨床特征相關性研究
　　目的：
　　從構建的lncRNA數據庫中找到一條在HCC中差異表達的lncRNA，明確其在HCC中的診斷價值。
　　方法：
　　利用前期建立的lncRNA數據庫，結合相關文獻調研篩選出10條高表達lncRNA。通過在H

19、CC患者組織及血漿中驗證，明確是否存在高表達的lncRNA。ROC曲線分析計算診斷靈敏度和特異性。利用qRT-PCR實驗檢測候選lncRNA在組織、血漿及細胞系（Hep3B、HepG-2、SMMC-7721、Huh7.5、LO2）中表達量。統(tǒng)計分析差異表達lncRNA在血漿中的穩(wěn)定性，與外周血細胞間關系，不同細胞系中表達情況，在HCC患者術前、術后及復發(fā)時表達量的變化情況和與臨床特征間的相關性。
　　結果：
　　有報道稱，同

20、種lncRNA可在不同腫瘤中進行調控，同種腫瘤也可受到多種不同lncRNA的影響。結合文獻調研從構建的脊柱轉移瘤lncRNA表達譜中篩選出10條高表達lncRNA。經過在HCC患者組織及血漿中驗證后，發(fā)現(xiàn)lnc34822在HCC中表達量顯著上調（P<0.01），并且可以在血漿中穩(wěn)定表達。Lnc34822在肝癌細胞系中表達量明顯高于正常肝細胞系，且與外周血細胞沒有相關性。ROC曲線分析顯示，lnc34822對HCC具有一定的診斷價值。Ln

21、c34822在HCC患者術后血漿中表達量明顯降低，而復發(fā)時又迅速升高，由此推斷l(xiāng)nc34822有望成為一個動態(tài)監(jiān)測HCC患者病情進展的血漿標志物。通過與臨床信息相關性分析發(fā)現(xiàn)lnc34822血漿中表達量與AFP及肝上腫瘤個數呈正相關。肝癌患者血液中AFP含量顯著升高，目前已成為臨床上廣泛應用的腫瘤標志物。肝上腫瘤數量越多病情越嚴重。進一步說明了lnc34822有望成為HCC潛在的血漿診斷標志物。
　　結論：
　　Lnc348