長(zhǎng)鏈非編碼RNA在腎癌靶向治療耐藥中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　近年來(lái)，在世界范圍內(nèi)腎細(xì)胞癌(RCC)的發(fā)生率逐年上升。約20％的腎癌患者在疾病診斷時(shí)已經(jīng)發(fā)生腫瘤的進(jìn)展轉(zhuǎn)移，而且近30％的局限性腎癌患者在腫瘤切除后會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。隨著對(duì)腎癌發(fā)病機(jī)制的深入探索，受體酪氨酸激酶抑制劑被作為進(jìn)展性腎癌患者的一線治療方案。舒尼替尼(Sunitinib，Sutent)是一種口服、多靶點(diǎn)受體酪氨酸激酶抑制劑，可以抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)、血小板源性生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)、

2、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(KIT)等多種受體酪氨酸激酶的活性，因此，舒尼替尼具有抑制腫瘤血管和殺傷腫瘤細(xì)胞的雙重作用。但是約10-20％的進(jìn)展性腎癌患者在初次治療時(shí)就對(duì)舒尼替尼先天耐藥，而其余的患者往往在接受舒尼替尼治療6-15個(gè)月后出現(xiàn)耐藥和疾病進(jìn)展，這些現(xiàn)狀使得舒尼替尼并不能有效延長(zhǎng)腎癌患者的生存期。許多研究提出信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)旁路的活化可能是腎癌舒尼替尼耐藥的潛在原因，然而其生物學(xué)機(jī)制尚待闡明。另一方面，目前尚缺乏預(yù)測(cè)舒尼替尼治療療效的生物學(xué)標(biāo)

3、志物。因此，探索腎癌舒尼替尼耐藥的生物學(xué)機(jī)制以及尋找預(yù)測(cè)舒尼替尼治療療效的生物學(xué)標(biāo)志物十分迫切。
　　近幾年，隨著二代測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，原本認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄“噪音”的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)被證明具有重要的生物學(xué)作用。lncRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度大于200個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄本，其不編碼蛋白或者僅編碼很短的多肽。研究表明lncRNA可在多水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，包括參與染色質(zhì)印記，與表觀修飾復(fù)合物或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，與miRN

4、A、mRNA或蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控等。越來(lái)越多的證據(jù)表明lncRNA參與調(diào)節(jié)腫瘤的多種生物學(xué)特性，包括增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、代謝等，然而lncRNA在腫瘤耐藥尤其是舒尼替尼耐藥中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　因此，本課題的研究目的是探討lncRNA在腎癌舒尼替尼耐藥中的生物學(xué)作用及分子機(jī)制，為舒尼替尼抵抗的腎癌患者提供新的聯(lián)合治療靶點(diǎn)，并且尋找可預(yù)測(cè)腎癌舒尼替尼治療反應(yīng)性的組織學(xué)和血清學(xué)標(biāo)志物，為腎癌的個(gè)性化治療提供重要參考。

5、r>　　研究方法:
　　1.利用裸鼠皮下荷瘤模型和體內(nèi)連續(xù)傳代方法構(gòu)建舒尼替尼耐藥的腎癌細(xì)胞系。
　　2.利用lncRNA表達(dá)譜芯片篩選舒尼替尼耐藥的腎癌細(xì)胞系和親本細(xì)胞系中差異表達(dá)的lncRNA。
　　3.利用腎癌臨床樣本以及患者移植瘤樣本對(duì)lncRNA表達(dá)水平進(jìn)行篩選。
　　4.利用RNAi方法從上述lncRNA中篩選出對(duì)耐藥細(xì)胞具有增敏作用的lncRNA進(jìn)行后續(xù)研究。
　　5.利用5'RACE和3'R

6、ACE技術(shù)克隆lncARSR轉(zhuǎn)錄本的全長(zhǎng)，并利用生物信息學(xué)(PhyloC SF、ORF-finder、CPAT)分析lncARSR的非編碼特性。
　　6.根據(jù)5'RACE結(jié)果，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)lncARSR的啟動(dòng)子區(qū)可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子FOXO，利用ChIP-qPCR驗(yàn)證FOXO對(duì)lncARSR啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合。
　　7.利用Ambion公司的mirVana(@) PARIS(@)試劑盒抽取腎癌患者血漿中的RNA，利用Re

7、altime PCR和PCR產(chǎn)物測(cè)序確定血漿中l(wèi)ncARSR的存在。
　　8.利用腎癌患者接受舒尼替尼治療前及治療過(guò)程中的血樣，分析血漿中l(wèi)ncARSR水平與腎癌患者舒尼替尼反應(yīng)性和無(wú)進(jìn)展生存期的相關(guān)性，多因素分析評(píng)判l(wèi)ncARSR作為患者預(yù)后判定的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素的可能性。
　　9.利用腎癌患者接受舒尼替尼治療前的腫瘤組織樣本，通過(guò)RNA原位雜交檢測(cè)組織中l(wèi)ncARSR表達(dá)水平，分析組織中l(wèi)ncARSR水平與腎癌患者舒尼替尼反

8、應(yīng)性和無(wú)進(jìn)展生存期的相關(guān)性，多因素分析評(píng)判l(wèi)ncARSR作為患者預(yù)后判定的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素的可能性。
　　10.利用超高速離心的方法抽提細(xì)胞培養(yǎng)上清中的外泌體，檢測(cè)不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體中l(wèi)ncARSR的表達(dá)量。
　　11.利用RNA pull-down、RIP實(shí)驗(yàn)，研究lncARSR進(jìn)入外泌體的機(jī)制。
　　12.通過(guò)共培養(yǎng)、外泌體孵育、外泌體瘤內(nèi)注射等研究外泌體傳播舒尼替尼耐藥的作用。
　　13.利用慢病毒介導(dǎo)的ln

9、cARSR過(guò)表達(dá)腎癌細(xì)胞系，研究lncARSR對(duì)腎癌敏感細(xì)胞的舒尼替尼反應(yīng)性的影響。
　　14.利用慢病毒介導(dǎo)的shRNA敲低腎癌耐藥細(xì)胞系中l(wèi)ncARSR的表達(dá)，研究lncARSR對(duì)耐藥細(xì)胞的舒尼替尼敏感性的影響。
　　15.利用Western blot篩選表達(dá)受lncARSR調(diào)控的受體酪氨酸激酶，并在臨床樣本中進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　16.利用Rescue方法，證明AXL與c-MET介導(dǎo)了lncARSR促進(jìn)舒尼替尼耐藥性

10、的作用。
　　17.利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)lncARSR與AXL/c-MET共有的miR-34/449結(jié)合序列，通過(guò)MS2-RIP實(shí)驗(yàn)、報(bào)告基因以及Western blot研究lncARSR對(duì)miRNA-34/449的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合作用。
　　18.利用裸鼠腎原位和皮下荷瘤模型，研究特異性靶向lncARSR的鎖核酸(LNA)或AXL/c-MET抑制劑對(duì)腎癌耐藥移植瘤的舒尼替尼反應(yīng)性的作用。
　　研究結(jié)果:
　　1.腎癌舒

11、尼替尼耐藥細(xì)胞與敏感細(xì)胞的lncRNA表達(dá)譜存在顯著差異。
　　2.通過(guò)腎癌臨床樣本、患者移植瘤樣本及RNAi功能實(shí)驗(yàn)篩選出一條在腎癌耐藥細(xì)胞高表達(dá)且有功能的lncRNA，命名為lncARSR(lncRNA Activated in RCC withSunitinib Resistance)。
　　3.與治療前腎癌組織相比，舒尼替尼治療后耐藥復(fù)發(fā)的組織中l(wèi)ncARSR表達(dá)升高。
　　4.轉(zhuǎn)錄因子FOXO1和FOXO3a

12、通過(guò)招募組蛋白去乙?；敢种苐ncARSR的轉(zhuǎn)錄。
　　5.腎癌患者血漿中可檢測(cè)到lncARSR，且舒尼替尼耐藥患者的血漿中l(wèi)ncARSR水平更高。
　　6.接受舒尼替尼治療后腎癌患者血漿中l(wèi)ncARSR高表達(dá)組患者的無(wú)進(jìn)展生存期低于lncARSR低表達(dá)組，且血漿lncARSR可作為患者預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。
　　7.腫瘤組織中l(wèi)ncARSR低表達(dá)組患者對(duì)舒尼替尼治療敏感，而lncARSR高表達(dá)組患者對(duì)舒尼替尼治療不敏感

13、。并且在lncARSR低表達(dá)組，舒尼替尼治療與患者的更好預(yù)后具有相關(guān)性。
　　8.hnRNPA2B1參與調(diào)控lncARSR進(jìn)入外泌體。
　　9.耐藥細(xì)胞通過(guò)外泌體介導(dǎo)lncARSR在細(xì)胞間的傳遞，促進(jìn)舒尼替尼耐藥表型的播散。
　　10.過(guò)表達(dá)lncARSR可提高腎癌敏感細(xì)胞對(duì)舒尼替尼的耐藥性。
　　11.敲低lncARSR表達(dá)可恢復(fù)腎癌耐藥細(xì)胞對(duì)舒尼替尼的敏感性。
　　12.lncARSR通過(guò)促進(jìn)AXL與c

14、-MET的表達(dá)促進(jìn)腎癌細(xì)胞舒尼替尼耐藥。
　　13.lncARSR作為ceRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA-34/449家族，拮抗miRNA-34/449對(duì)AXL和c-MET的抑制作用，促進(jìn)AXL和c-MET的表達(dá)。
　　14.特異性靶向lncARSR的鎖核酸或AXL/c-MET抑制劑可以增加耐藥移植瘤對(duì)舒尼替尼的敏感性。
　　研究結(jié)論：
　　本研究通過(guò)lncRNA表達(dá)譜芯片、臨床樣本和功能實(shí)驗(yàn)篩選出一條在腎癌舒尼替尼

15、耐藥細(xì)胞中高表達(dá)且有功能的新的lncRNA，命名為lncARSR。lncARSR可通過(guò)外泌體從耐藥細(xì)胞傳遞至周?chē)?xì)胞，促進(jìn)耐藥表型的播散。臨床研究表明腫瘤組織和血漿中l(wèi)ncARSR高表達(dá)的腎癌患者對(duì)舒尼替尼治療反應(yīng)性差。機(jī)制研究表明，lncARSR作為ceRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA-34和miRNA-449家族，拮抗miRNA-34/449對(duì)AXL和c-MET的抑制作用，促進(jìn)AXL和c-MET表達(dá)及下游STAT3、AKT、ERK信號(hào)通路