長(zhǎng)鏈非編碼RNA DMTF1v4(NR_024549)在胃癌多藥耐藥中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、【背景】
　　胃癌是我國(guó)致死人數(shù)最多的癌癥之一。由于多藥耐藥現(xiàn)象的存在，常常導(dǎo)致化療失敗。多藥耐藥（MDR：multidrug resistance）即指惡性腫瘤同時(shí)對(duì)多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥?？煞譃閮煞N，一種為天然性耐藥(intrinsic resistance),即化療前即有耐藥；另一種為獲得性耐藥(acquired resistance)，即化療過程中產(chǎn)生的耐藥。多藥耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，針對(duì)惡性腫瘤治療抗性

2、問題，從以往的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白翻譯水平均未能深入地解答這些問題，需要通過新的角度來深入探索，以闡明胃癌耐藥的機(jī)制。
　　長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,簡(jiǎn)稱lncRNA）是最近備受矚目的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄組重要成員。與蛋白編碼基因相比，它具有明顯的組織特異性及發(fā)育階段特異性，更可從多個(gè)角度調(diào)節(jié)蛋白編碼基因的表達(dá)及修飾，如對(duì)蛋白編碼基因的表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)等。因此，lncRNA失調(diào)成為多種癌癥的特征之一。lncRNA的

3、發(fā)現(xiàn)為研究惡性腫瘤的生物學(xué)行為、揭示惡性腫瘤化療耐藥本質(zhì)提供了重要契機(jī)。研究多藥耐藥細(xì)胞與親本藥敏細(xì)胞之間lncRNA表達(dá)譜變化，并深入研究這些差異表達(dá)lncRNA分子與相應(yīng)表觀遺傳修飾劑之間的相互作用對(duì)重要耐藥相關(guān)分子基因發(fā)生表觀基因組學(xué)變化的影響及機(jī)制將為解析惡性腫瘤多藥耐藥機(jī)制提供新視角，以及治療的新靶點(diǎn)和新策略。
　　【目的】
　　通過高通量lncRNA芯片比較胃癌耐藥細(xì)胞與親本細(xì)胞lncRNA表達(dá)譜差異；通過差異倍

4、數(shù)、基因位點(diǎn)比對(duì)、鄰近編碼基因信息分析、phylop物種進(jìn)化保守性評(píng)分等多步篩選策略篩選胃癌耐藥相關(guān)lncRNAs分子；對(duì)其中關(guān)鍵lncRNAs分子在胃癌耐藥細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證；探討關(guān)鍵lncRNAs分子在胃癌組織中的表達(dá)水平與胃癌組織體外組織培養(yǎng)藥物敏感度的相關(guān)性；進(jìn)一步探討關(guān)鍵lncRNAs分子對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞表型的影響及其機(jī)制，從而為逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞耐藥治療提供新的靶點(diǎn)以及為關(guān)鍵lncRNAs分子未來應(yīng)用于臨床奠定初步的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依

5、據(jù)。
　　【方法】
　　1.利用高通量lncRNA芯片(Human LncRNA Microarray V1.0：Human_HX12_LNC; Genome Build:HG18,Build36; http://www.arraystar.com/Products/product_main.aspid=239)比較胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/ADR、SGC7901/VCR與親本細(xì)胞SGC7901 lncRNA表達(dá)譜差異。

6、
　　2.通過差異倍數(shù)、鄰近編碼基因信息分析、基因位點(diǎn)比對(duì)、phylop物種進(jìn)化保守性評(píng)分、表達(dá)驗(yàn)證等多步篩選策略初步篩選胃癌耐藥相關(guān)lncRNAs分子。
　　3.通過實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證lncRNA DMTF1v4在40例胃癌臨床標(biāo)本中相對(duì)于正常癌旁組織的表達(dá)水平；分別檢測(cè)40例胃癌標(biāo)本體外組織培養(yǎng)藥物敏感率，并分析DMTF1v4的表達(dá)水平與藥物敏感率之間相關(guān)性。
　　4.以小干擾RNA瞬轉(zhuǎn)下調(diào)DMTF1v4在胃癌耐藥

7、細(xì)胞株SGC7901/ADR以及SGC7901/VCR中的表達(dá)，通過MTT檢測(cè)、平板克隆實(shí)驗(yàn)、藥物半數(shù)致死劑量（IC50）檢測(cè)等驗(yàn)證DMTF1v4的下調(diào)對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞藥物敏感度的影響。
　　5.通過流式細(xì)胞術(shù)、蛋白印跡實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)DMTF1v4下調(diào)在不同相應(yīng)時(shí)間對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR凋亡的影響。
　　6.以阿霉素蓄積潴留實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DMTF1v4下調(diào)不同時(shí)間后，化療藥物阿霉素在胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR中蓄積

8、以及外排比例。
　　7.通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DMTF1v4下調(diào)后對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR及SGC7901/VCR中耐藥關(guān)鍵蛋白的影響。
　　8.構(gòu)建DMTF1v4下調(diào)慢病毒載體，并成功建立DMTF1v4下調(diào)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系LV- DMTF1v4 SGC7901/ADR,構(gòu)建裸鼠皮下異位胃癌耐藥細(xì)胞移植瘤模型，檢測(cè)DMTF1v4的下調(diào)對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞藥物敏感度的影響。
　　9.慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)以及小干擾RNA瞬轉(zhuǎn)下調(diào)DM

9、TF1v4后，通過實(shí)時(shí)定量PCR、蛋白印跡等實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)SGC7901/ADR細(xì)胞株中于不同時(shí)間隨著DMTF1v4表達(dá)水平變化而導(dǎo)致P-糖蛋白表達(dá)水平的變化。
　　10.以LV-DMTF1v4 SGC7901/ADR細(xì)胞構(gòu)建裸鼠皮下異位移植瘤模型，4周后取腫瘤組織切片，以免疫組織化學(xué)、免疫熒光染色以及蛋白印跡實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)DMTF1v4下調(diào)組與對(duì)照組P-糖蛋白表達(dá)水平差異。
　　11.克隆DMTF1v4分子含啟動(dòng)子上游1500b

10、p及第一個(gè)外顯子在內(nèi)的DNA片段，分別與DMTF1v4分子cDNA第一個(gè)外顯子以外其他不同區(qū)段PCR產(chǎn)物通過同源重組原理構(gòu)建DMTF1v4分子不同片段，將其通過同源重組插入熒光素酶報(bào)告基因載體pGL4.24中并轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性之比的變化并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　【結(jié)果】
　　1．高通量lncRNA芯片比較發(fā)現(xiàn)：SGC7901/ADR、SGC7901/VCR與親本細(xì)胞SGC7901相比分別有1

11、499以及1420條差異表達(dá)lncRNAs，并且，相交集的差顯lncRNAs有627條，其中，NR_024549(DMTF1v4)可能是胃癌耐藥關(guān)鍵分子。
　　我們通過高通量lncRNA芯片(Human LncRNA Microarray V1.0)比較了胃癌耐藥細(xì)胞系與其親本細(xì)胞lncRNA表達(dá)譜差異。Change fold>=2.0者被認(rèn)為存在差異表達(dá)。基于以上篩選策略，我們發(fā)現(xiàn)與親本細(xì)胞SGC7901相比，SGC7901/A

12、DR、SGC7901/VCR細(xì)胞系分別有1499以及1420條差異表達(dá)lncRNAs，相交集的差顯lncRNAs有627條（lncRNA-Cs）。其中，change fold>=4.0者共有32個(gè)，包括在胃癌耐藥細(xì)胞中上調(diào)的NR_024549,NR_024074,uc002hfi,uc001vtj,uc003wbn,NR_026673,NR_015379,uc002odt,uc010heq,NR_027241,uc002wcb,uc01

13、0hhg,uc001aqd,uc002jmb,uco o3wig,uc003whs,以及下調(diào)的NR_026867，NR_027339，NR_027282,uc002uov,uc003gnd,uc001ras,uc002rvu,uc003dhh,uc010jya,uc001 ekz,uc003tbi,uc001jtu,uc010itd,uc002ued,uc010dga,uc010cny。其中，NR_024549（DMTF1v4）在兩耐藥

14、細(xì)胞中（相對(duì)親本細(xì)胞）上調(diào)倍數(shù)最為顯著（SGC7901/ADR-SGC7901 change fold=25.89 SGC7901/VCR-SGC7901 change fold=21.42）。
　　2.通過差異倍數(shù)、鄰近編碼基因信息分析、phylop物種進(jìn)化保守性評(píng)分、表達(dá)驗(yàn)證等多步篩選策略提示DMTF1v4可能是胃癌耐藥關(guān)鍵lncRNA分子。
　　1）基因芯片差異倍數(shù)結(jié)果顯示：與親本細(xì)胞相比，NR_024549（DMTF

15、1v4）在兩耐藥細(xì)胞中上調(diào)倍數(shù)最為顯著（SGC7901/ADR-SGC7901 change fold=25.89 SGC7901/VCR-SGC7901 change fold=21.42）。
　　2）鄰近編碼基因信息分析表明：以800Kb范圍分析627條lncRNA-Cs鄰近編碼基因信息中，發(fā)現(xiàn)，分別有大約5％，21%及12%的lncRNA-Cs基因位點(diǎn)附近存在耐藥相關(guān)基因，致癌基因及抑癌基因的表達(dá)。其中，距DMTF1v4下游

16、307Kb處即為經(jīng)典耐藥關(guān)鍵基因ABCB1(MDR1：P-糖蛋白編碼基因)。
　　3） phylop物種進(jìn)化保守性評(píng)分表明：lncRNA DMTF1v4具有較高多物種間進(jìn)化保守性。（Mean±Sd：0.245989±1.14945）
　　4）實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示：相對(duì)于親本細(xì)胞SGC7901，DMTF1v4在兩耐藥細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯上調(diào)，且上調(diào)水平相對(duì)于其他15條lncRNA芯片結(jié)果中上調(diào)表達(dá)的lncRNAs（chan

17、ge fold>=4.0）最為顯著。
　　3. lncRNA DMTF1v4在原發(fā)性胃腺癌組織中的表達(dá)水平與體外組織培養(yǎng)藥物敏感率呈負(fù)相關(guān)。
　　我們首先通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)40例原發(fā)胃腺癌組織中DMTF1v4與癌旁正常組織相比的相對(duì)表達(dá)水平，根據(jù)中位數(shù)，將40例原發(fā)胃腺癌組織分為DMTF1v4高表達(dá)組及低表達(dá)組。分別檢測(cè)兩組胃腺癌組織體外組織培養(yǎng)藥物（阿霉素）抑制率，發(fā)現(xiàn)DMTF1v4表達(dá)水平與藥物抑制率呈負(fù)相關(guān)。并且，

18、DMTF1v4高表達(dá)組及低表達(dá)組中，DMTF1v4的表達(dá)水平與藥物抑制率呈線性負(fù)相關(guān)（p<0.05）。
　　4. DMTF1v4的下調(diào)增加了胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/ADR以及SGC7901/VCR對(duì)P-糖蛋白相關(guān)化療藥物敏感度。
　　為檢測(cè)DMTF1v4對(duì)胃癌細(xì)胞耐藥表型的影響，我們首先使用以小干擾RNA瞬轉(zhuǎn)的方法下調(diào)該分子在胃癌耐藥細(xì)胞系中的表達(dá)，通過系列檢測(cè)方法驗(yàn)證其在胃癌細(xì)胞耐藥中的功能。
　　1） MTT

19、檢測(cè)結(jié)果表明：DMTF1v4表達(dá)水平下調(diào)后，SGC7901/ADR以及SGC7901/VCR細(xì)胞在阿霉素、長(zhǎng)春新堿等P-糖蛋白相關(guān)化療藥物作用下生長(zhǎng)率顯著低于對(duì)照組。
　　2）平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示：DMTF1v4表達(dá)水平的下調(diào)顯著抑制了SGC7901/ADR細(xì)胞在阿霉素作用時(shí)的細(xì)胞克隆形成率。
　　3）藥物半數(shù)致死劑量（IC50）檢測(cè)表明：DMTF1v4表達(dá)水平的下調(diào)顯著增加了SGC7901/ADR細(xì)胞對(duì)P-糖蛋白相關(guān)化療藥物如

20、阿霉素、長(zhǎng)春新堿、紫杉醇等的敏感度。
　　5.下調(diào)DMTF1v4的表達(dá)能顯著增加SGC7901/ADR細(xì)胞的凋亡。
　　通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，下調(diào)DMTF1v4表達(dá)水平導(dǎo)致SGC7901/ADR細(xì)胞與對(duì)照組相比72h后凋亡比例顯著增加。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)也表明，DMTF1v4下調(diào)組于72h后Bcl-2表達(dá)水平顯著下降而Bax表達(dá)水平顯著上調(diào)，Bcl-2/Bax比例下降。
　　6. DMTF1v4表達(dá)水平下調(diào)使胃癌耐藥細(xì)胞S

21、GC7901/ADR中化療藥物阿霉素蓄積比例增加、外排比例減少。
　　阿霉素蓄積潴留實(shí)驗(yàn)表明：相對(duì)于對(duì)照組，DMTF1v4表達(dá)下調(diào)72h后，化療藥物阿霉素在胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR中蓄積比例增加，外排比例減少。
　　7.下調(diào)DMTF1v4表達(dá)使SGC7901/ADR及SGC7901/VCR細(xì)胞中耐藥關(guān)鍵蛋白P-糖蛋白表達(dá)水平下調(diào)。
　　通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)表明DMTF1v4下調(diào)3d后，胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/

22、ADR及SGC7901/VCR中耐藥關(guān)鍵蛋白P-糖蛋白表達(dá)下調(diào)，而多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）的表達(dá)沒有顯著變化。
　　8.裸鼠皮下異位移植瘤實(shí)驗(yàn)表明DMTF1v4下調(diào)組腫瘤增殖被抑制。
　　構(gòu)建DMTF1v4下調(diào)慢病毒載體，以DMTF1v4下調(diào)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系LV-DMTF1v4 SGC7901/ADR構(gòu)建裸鼠皮下異位胃癌耐藥細(xì)胞移植瘤模型，尾靜脈注射0.5mg/Kg阿霉素1次/周，于規(guī)定時(shí)間測(cè)量腫瘤體積及重量，結(jié)果表明，與對(duì)照組

23、相比，DMTF1v4下調(diào)組腫瘤增殖明顯受抑制。
　　9.DMTF1v4表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致SGC7901/ADR細(xì)胞P-糖蛋白表達(dá)水平隨之顯著下調(diào)。
　　以慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)以及小干擾RNA瞬轉(zhuǎn)在SGC7901/ADR細(xì)胞中下調(diào)DMTF1v4的表達(dá)后，實(shí)時(shí)定量PCR以及蛋白印跡等實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示P-糖蛋白表達(dá)水平也隨之顯著下降。
　　10.裸鼠皮下異位成瘤實(shí)驗(yàn)表明，DMTF1v4下調(diào)組P-糖蛋白表達(dá)水平顯著下降。
　　以LV-DMT

24、F1v4 SGC7901/ADR細(xì)胞構(gòu)建裸鼠皮下異位移植瘤模型，4周后取腫瘤組織切片，以免疫組織化學(xué)、免疫熒光染色以及蛋白印跡實(shí)驗(yàn)等表明DMTF1v4下調(diào)組與對(duì)照組相比P-糖蛋白表達(dá)水平顯著下降。
　　11.雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果表明，DMTF1v4通過增強(qiáng)子樣作用促進(jìn)P-糖蛋白的表達(dá)。通過克隆DMTF1v4分子含啟動(dòng)子上游1500bp及第一個(gè)外顯子在內(nèi)的DNA片段，分別與DMTF1v4分子cDNA第一個(gè)外顯子以外其他不同區(qū)段PC

25、R產(chǎn)物通過同源重組原理構(gòu)建DMTF1v4分子不同片段，將其通過同源重組插入熒光素酶報(bào)告基因載體pGL4.24中并轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性之比的變化并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)DMTF1v4，尤其是在相當(dāng)于其外顯子540bp 至其1400 bp片段區(qū)域?qū)-糖蛋白的表達(dá)有增強(qiáng)子樣作用。
　　【結(jié)論】通過高通量lncRNA芯片比較，我們首次發(fā)現(xiàn)了一組胃癌多藥耐藥相關(guān)lncRNAs分子，而DMTF1v4可能是這組分