長鏈非編碼RNA FER1L4抑制胃癌發(fā)生的分子機制研究.pdf

1、研究目的：
　　我國是胃癌多發(fā)的國家，居世界之首。研究表明，長鏈非編碼 RNA（long noncoding RNA，lncRNA）與胃癌發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。lncRNA的作用機制多種多樣，它可以通過RNA產(chǎn)物和轉(zhuǎn)錄后干擾等調(diào)控基因的表達。雖然，人們對lncRNA的作用機制有一定的認識，但是lncRNA研究還處于起步階段，還有很多問題尚未解決。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn) fer-1樣家族成員4（fer-1-like family mem

2、ber4，F(xiàn)ER1L4）這一lncRNA在胃癌組織中低表達，但其具體作用機制尚不完全清楚。為此，本論文以FER1L4作為研究的對象，采用多種技術(shù)手段，探究FER1L4抑制胃癌發(fā)生的機制。
　　實驗方法：
　　1.采用功能缺失策略，設(shè)計FER1L4的shDNA模板序列，將其插入慢病毒干擾載體pGLV3/H1/GFP+Puro中，構(gòu)建慢病毒干擾載體，使其能轉(zhuǎn)錄出FER1L4的shRNA。
　　2.采用功能獲得策略，合成FE

3、R1L4功能片段，并將其插入慢病毒表達載體pLVX-Puro中，構(gòu)建慢病毒過表達載體。
　　3.慢病毒干擾載體和慢病毒過表達載體分別與包裝載體一起共轉(zhuǎn)染人腎HEK293T工具細胞，進行慢病毒包裝，以獲得病毒液。
　　4.病毒液感染正常胃黏膜上皮細胞GES-1和不同分化程度的胃癌細胞AGS、MGC-803和SGC-7901。Puromycin篩選穩(wěn)定下調(diào)和上調(diào)FER1L4的細胞株。
　　5.收集穩(wěn)定下調(diào)和上調(diào)FER1L4

4、細胞株，提取總RNA，對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄和FER1L4的實時熒光定量分析，檢測FER1L4水平是否下調(diào)和上調(diào)。
　　6. RTCA檢測穩(wěn)定下調(diào)和上調(diào)FER1L4后，細胞的增殖情況?？寺⌒纬蓪嶒灆z測穩(wěn)定下調(diào)和上調(diào)FER1L4后，細胞的克隆形成情況。
　　7.為進一步驗證FER1L4的抑癌作用，設(shè)計并合成FER1L4基因CRISPR Cas-9的sgRNA，并將其插入到CRISPR Cas-9載體pX330和pX335中。細胞

5、轉(zhuǎn)染，提取總RNA，檢測CRISPR Cas-9敲除FER1L4后，細胞中FER1L4 RNA的水平檢測。RTCA檢測CRISPR Cas-9敲除FER1L4后，細胞的增殖情況。
　　8.檢測下調(diào)和上調(diào)FER1L4后，細胞中PTEN的水平。檢測miR-106a-5p抑制劑處理正常胃黏膜上皮細胞株和胃癌細胞株后，F(xiàn)ER1L4和PTEN的水平，以證明FER1L4和PTEN mRNA的競爭性內(nèi)源RNA關(guān)系。
　　實驗結(jié)果：

6、　　1.成功建立FER1L4慢病毒穩(wěn)定干擾細胞和慢病毒穩(wěn)定過表達細胞株，qRT-PCR檢測到細胞中FER1L4的水平的下降和上升符合預(yù)期。
　　2.細胞中FER1L4水平下調(diào)后，細胞增殖加快，克隆增多；而細胞中FER1L4水平上調(diào)后，細胞增殖減慢，克隆減少。
　　3.篩選出4個CRISPR Cas-9 sgRNA，pX335插入sgRNA4后，能促進細胞的增殖。
　　4.下調(diào)FER1L4的水平后，PTEN的mRNA水平