長鏈非編碼RNA分子UCA1介導(dǎo)胃癌多藥耐藥的機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，化療是治療中晚期胃癌的重要手段，多藥耐藥是胃癌患者化療失敗的主要原因。腫瘤耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，既往研究主要集中在僅占基因組2％左右的蛋白編碼基因上，顯然不能根本闡明腫瘤復(fù)雜的耐藥機(jī)制。而占基因組98%的非編碼基因在近年來越來越受到人們重視，成為攻克腫瘤耐藥難題的希望所在。非編碼基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生非編碼 RNA，包括長鏈非編碼 RNA和短鏈非編碼RNA，其中以長鏈非編碼RNA為主要組成部分。長鏈非

2、編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸的非編碼RNA分子，其不編碼蛋白，而是以RNA的形式通過多種機(jī)制參與基因表達(dá)調(diào)控。近年來，lncRNA已被證實(shí)在腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用，然而目前l(fā)ncRNA在胃癌多藥耐藥中的作用尚不清楚。前期，我們通過高通量表達(dá)譜芯片篩選得到了一批在胃癌多藥耐藥細(xì)胞差異表達(dá)的lncRNA和miRNA分子。本研究綜合分析芯片中差異表達(dá)的l

3、ncRNA分子，發(fā)現(xiàn)UCA1與胃癌耐藥密切相關(guān)，并通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了UCA1在胃癌耐藥中的作用。其后，結(jié)合 miRNA芯片數(shù)據(jù)通過生物信息學(xué)分析找到了與UCA1相互作用的miRNA let-7，并通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)闡明了UCA1作為競爭內(nèi)源性RNA通過結(jié)合let-7促進(jìn)下游靶分子HMGA2表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)胃癌多藥耐藥的分子機(jī)制。
　　目的：
　　1.篩選和驗(yàn)證胃癌耐藥相關(guān)lncRNA分子。
　　2.通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究U

4、CA1對胃癌多藥耐藥的調(diào)節(jié)作用。
　　3.闡明UCA1調(diào)節(jié)胃癌多藥耐藥的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.分析高通量表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)，篩選差異表達(dá)的lncRNA分子，并通過qRT-PCR驗(yàn)證候選分子的表達(dá)。通過qRT-PCR在不同細(xì)胞系和胃癌組織中驗(yàn)證UCA1的表達(dá)。2. MTT實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證UCA1對胃癌多藥耐藥的調(diào)節(jié)作用，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證UCA1對體內(nèi)胃癌細(xì)胞化療敏感性的調(diào)節(jié)作用。
　　3

5、.熒光原位雜交和胞漿胞核分離實(shí)驗(yàn)檢測UCA1的細(xì)胞內(nèi)定位和分布。
　　4.生物信息學(xué)分析預(yù)測與UCA1結(jié)合的miRNA和蛋白，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)和RIP實(shí)驗(yàn)分別證實(shí)UCA1與miRNA、UCA1與蛋白的相互作用。
　　5.通過qRT-PCR、MTT、流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡驗(yàn)證let-7e和HMGA2在胃癌耐藥細(xì)胞的表達(dá)及其對胃癌耐藥的調(diào)節(jié)作用。western blot驗(yàn)證let-7e對靶基因HMGA2的負(fù)向調(diào)控關(guān)系。通過we

6、stern blot和相關(guān)分析驗(yàn)證UCA1對HMGA2的正向調(diào)節(jié)作用。通過let-7e結(jié)合位點(diǎn)突變證實(shí)UCA1調(diào)節(jié)HMGA2表達(dá)需要let-7e參與。
　　結(jié)果：
　　1.高通量芯片篩選獲得19個在兩株胃癌耐藥細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)10倍以上的lncRNA，qRT-PCR證實(shí)UCA1在兩株耐藥細(xì)胞系中表達(dá)顯著上調(diào)。通過qRT-PCR檢測，還發(fā)現(xiàn)UCA1在白血病耐藥細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，在其他消化系腫瘤如胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、食管癌細(xì)胞系中，

7、UCA1同樣表達(dá)上調(diào)。臨床樣本中檢測UCA1表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，UCA1在胃癌組織中表達(dá)顯著高于配對的癌旁正常組織。
　　2. UCA1可顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞對化療藥ADR、5-FU和CDDP產(chǎn)生耐藥，這種調(diào)節(jié)作用與細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)相關(guān)。體內(nèi)試驗(yàn)同樣證實(shí)下調(diào) UCA1表達(dá)可降低胃癌細(xì)胞的化療敏感性。
　　3.熒光原位雜交和胞漿胞核分離實(shí)驗(yàn)證實(shí)UCA1主要分布在胞漿，胞核中也有少量分布，提示UCA1主要在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

8、>　　4. RegRNA、PITA和FINDTAR3數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn) UCA1全長序列包含 let-7家族miRNA結(jié)合位點(diǎn)，其中以 let-7e結(jié)合位點(diǎn)評分最高。LncRNAtor數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)UCA1可與AGO2蛋白結(jié)合。RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)，相對于對照IgG抗體，抗AGO2抗體可顯著富集AGO2-UCA1復(fù)合物，表明UCA1可與AGO2蛋白結(jié)合。Let-7e可降低UCA1雙熒光素酶報告基因的熒光素信號強(qiáng)度，UCA1上let-7e結(jié)合位點(diǎn)突

9、變可部分抑制這一效應(yīng)，表明UCA1可與let-7e直接結(jié)合。以上結(jié)果表明UCA1可作為競爭內(nèi)源性RNA，通過結(jié)合let-7發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用。
　　5. HMGA2是let-7已驗(yàn)證的下游靶分子。let-7e在胃癌耐藥細(xì)胞表達(dá)降低，HMGA2在胃癌耐藥細(xì)胞表達(dá)升高。過表達(dá) let-7e或干擾 HMGA2可降低胃癌耐藥細(xì)胞對ADR、5-FU和CDDP的IC50，同時化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增加。Let-7e可以負(fù)向調(diào)控HMGA2蛋白表

10、達(dá)，證實(shí)HMGA2是let-7e的下游靶分子。UCA1可以正向調(diào)控HMGA2蛋白表達(dá)，相關(guān)分析表明二者表達(dá)呈正相關(guān)。UCA1促進(jìn)HMGA2表達(dá)依賴于結(jié)合let-7，let-7結(jié)合位點(diǎn)突變可抑制這一效應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　UCA1在胃癌耐藥細(xì)胞、多種消化系腫瘤細(xì)胞及胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，是重要的耐藥相關(guān)基因和促癌因子。上調(diào) UCA1可促進(jìn)體內(nèi)、體外胃癌細(xì)胞的多藥耐藥性。UCA1作為競爭內(nèi)源性RNA，通過結(jié)合let-7（尤其是le