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文檔簡介
1、分娩是由多因素作用、多途徑調(diào)節(jié)、多分子參與、多階段變化的變互作用過程。子宮平滑肌的收縮是分娩發(fā)動的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。若能探明分娩發(fā)動機制對病理妊娠計劃分娩、減少早產(chǎn)及高危兒的出生,具有重要的臨床意義。在前期的研究中,我課題組已應(yīng)用基因芯片技術(shù)得到了人類自然臨產(chǎn)與未臨產(chǎn)子宮體部與子宮下段的差異基因表達譜,發(fā)現(xiàn)Calponin—1等在臨產(chǎn)后的子宮體部及下段均呈高表達,可能與調(diào)控子宮平滑肌細胞功能密切相關(guān)。Calponin-1蛋白結(jié)構(gòu)已經(jīng)研究清楚,但
2、對它在平滑肌收縮功能的調(diào)節(jié)機制研究大多集中在血管平滑肌上,對其參與子宮平滑肌收縮的調(diào)節(jié)機制研究較少。本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上進一步探討Calponin-1基因表達上調(diào)在分娩發(fā)動中調(diào)控子宮平骨肌細胞的分子機制。
目的:探討Calponin-1在臨產(chǎn)前后子宮平滑肌組織中的表達及意義。
方法:選取14例初產(chǎn)婦的子宮體部和子宮下段平滑肌組織,分為未臨產(chǎn)組(NIL)和臨產(chǎn)組(IL),采用免疫組織化學(xué)(Immunohis
3、tochemistry)和免疫印跡(western-blot)方法檢測Calponin-1蛋白(calponin—1)和磷酸化Calponin-1蛋白(pCalponin—1)的表達。
結(jié)果:
1.免疫組織化學(xué)
14例子宮平滑肌組織中均可見Calponin—1及pCalponin-1蛋白陽性表達,陽性表達定位在平滑肌細胞胞漿,呈棕黃色。
(1)在未臨產(chǎn)組(NIL)與臨產(chǎn)組(IL)子
4、宮體平滑肌組織中Calponin-1蛋白陽性表達的平均灰度值分別為:184.91±5.12和167.32±5.22,兩組比較差異具有顯著性(ρ〈0.05):在未臨產(chǎn)組(NIL)與臨產(chǎn)組(IL)子宮下段平滑肌組織中Calponin-1蛋白陽性表達的平均灰度值分別為:174.51±4.82和165.42±4.52,兩組比較差異具有顯著性(ρ<0.05)。
(2)在未臨產(chǎn)組(NIL)與臨產(chǎn)組(IL)子宮體平滑肌組織中pCalpo
5、nin-1蛋白陽性表達的平均灰度值分為:148.22±11.95和90.42±12.22,兩組比較差異具有顯著性(ρ<0.05);在未臨產(chǎn)組(NIL)與臨產(chǎn)組(IL)子宮下段平滑肌組織中pCalponin-1蛋白陽性表達的平均灰度值分別為:151.34±10.36和113.42±10.22,兩組比較差異具有顯著性(ρ<0.05)。
2.免疫印跡
(1)在未臨產(chǎn)組(NIL)與臨產(chǎn)組(IL)子宮體平滑肌組織中Ca
6、lponin-1蛋白的相對表達量分別為:0.373±0.092和0.865±0.090,兩組比較差異具有顯著性(ρ<0.05);在未臨產(chǎn)組(NIL)與臨產(chǎn)組(IL)子宮下段平滑肌組織中Calponin—1蛋白的相對表達量分別為:0.522±0.102和0.957±0.081,兩組比較差異具有顯著性(ρ<0.05)。
(2)pCalponin-1蛋白表達水平檢測結(jié)果顯示:未臨產(chǎn)組(NIL)和臨產(chǎn)(IL)組子宮體平滑肌組織中p
7、Calponin—1蛋白的相對表達量分別為:0.303±0.071和0.532±0.063,兩組比較差異具有顯著性(ρ<0.05),未臨產(chǎn)組(NIL)和臨產(chǎn)(IL)組子宮下段平滑肌組織中pCalponin-1蛋白的相對表達量分別為:0.274±0.091和0.567±0.085,兩組比較差異具有顯著性(ρ<0.05)。
結(jié)論:
臨產(chǎn)后子宮平滑肌組織中Calponin-1及pCalponin-1蛋白的表達上調(diào)與
8、臨產(chǎn)后子宮平滑肌的收縮狀態(tài)有關(guān),提示臨產(chǎn)后子宮平滑肌的收縮可能部分依賴于Calponin—1及pCalponin—1的表達。
目的:探討Calponin-1蛋白表達抑制對妊娠子宮平滑肌細胞功能的影響,研究其在分娩發(fā)動中的分子作用機制。
方法:采用消化酶法對人子宮平滑肌組織進行子宮平滑肌細胞原代培養(yǎng),并用免疫細胞化學(xué)方法進行鑒定。構(gòu)建腺病毒siRNA—Calponin-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染子宮平滑肌細胞沉默Calponi
9、n—1表達,采用MTT、流式細胞術(shù)、Transwell小室的變化、免疫熒光標記和熒光顯微鏡觀察平滑肌細胞骨架蛋白F-actin表達的變化等方法研究Calponin-1調(diào)控子宮平滑肌細胞的作用,實驗分三組:實驗組、空白對照組、空載體組。
結(jié)果:
1.原代子宮平滑肌細胞的培養(yǎng)及鑒定
培養(yǎng)的子宮平滑肌細胞呈典型的梭狀肌細胞樣生長,用平滑肌肌動蛋白抗體,經(jīng)免疫細胞化學(xué)染色顯示原代培養(yǎng)的子宮平滑肌細胞胞質(zhì)
10、呈棕色,證明獲得的原代子宮平滑肌細胞符合后續(xù)實驗的要求。
2.siRNA-Calponin-1腺病毒有效抑制Calponin—1 mRNA和蛋白的表達
采用RT—PCR和Western-blot方法檢測pAd-mU6pro-Calponin-1-siRNA轉(zhuǎn)染后子宮平滑肌細胞中Calponin—1mRNA和蛋白的表達,結(jié)果顯示:實驗組、陰性對照組、空白對照組Calponin—lmRNA的相對表達量分別為0.0
11、463±0.00045、0.2513±0.0552、0.3124±0.0037;實驗組、陰性對照組、空白對照組Calponin—1蛋白的相對表達量分別為0.1098±0.0127、0.2758±0.0384、0.3187±0.0425。實驗組與陰性對照組、空白對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(ρ<0.05),陰性對照組與空白對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(ρ>0.05)。
3.體外實驗中抑制Calponin-1的表達可以抑制子宮
12、平滑肌細胞的遷移運動而不影響其增殖和凋亡
Transwell侵襲小室測定法結(jié)果顯示24小時培養(yǎng)后實驗組、空載體組、空白對照組穿過Transwell的每低倍視野細胞數(shù)分別為64±12、122±14、125±10,實驗組與空載體組、空白對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(ρ<0.05);空載體組與空白對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。MTT法檢測轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后細胞的存活率,結(jié)果顯示三組細胞存活率兩兩比較差異
13、無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,三組細胞凋亡率分別為4.22%、3.02%、4.64%,兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。
4.體外實驗中抑制Calponin-1的表達可以引起子宮平滑肌細胞骨架蛋白F—actin的改變
實驗組子宮平滑肌細胞中F—actin排列紊亂、稀疏。空載體組與空白對照組子宮平滑肌細胞中F—actin微絲明顯粗長,大多沿細胞縱軸呈平行排列。實驗組、空載體組、空
14、白對照組子宮平滑肌細胞中的F—actin熒光強度分別為832.22±99.02、1123.32±102.35、1089.19±110.53,實驗組與空載體組、空白對照組比較差異具有顯著性(p<0.01);而空載體組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。
結(jié)論:
1.構(gòu)建的Calponin-lsiRNA干擾質(zhì)粒能有效沉默Calponin—1基因表達。
2.體外實驗中抑制Calponin
15、—1的表達可以抑制子宮平滑肌細胞的遷移運動而不影響其增殖和凋亡。
3.Calponin-1通過影響子宮平滑肌細胞中骨架蛋白F—actin的改變調(diào)節(jié)子宮平滑肌的收縮。
目的:探討硫酸鎂及縮宮素調(diào)節(jié)子宮平滑肌細胞收縮與Calponin-1表達水平的相關(guān)性。
方法:用硫酸鎂及縮宮素作用于體外培養(yǎng)的子宮平滑肌細胞,然后采用Western-blot及RT—PCR的方法對子宮平滑肌組織中Calponin-1
16、的表達進行檢測。
結(jié)果:
1.體外硫酸鎂對子宮平滑肌細胞Calponin-1表達的影響
2.體外縮宮素對子宮平滑肌細胞Calponin—1表達的影響
結(jié)論:
1.體外縮宮素可以上調(diào)子宮平滑肌細胞Calponin—1的表達,且與其濃度及作用時間具有相關(guān)性,但與縮宮素作用濃度及作用時間并無明顯正/或負相關(guān)。
2.縮宮素通過上調(diào)子宮平滑肌細胞Calponin-
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